中药药效活性成分遴选技术研究进展*

付人杰，戚 进，余伯阳

(中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198)

中医药学是两千多年临床实践经验的总结，其理论体系完整，具有深厚的历史积淀与深刻的临床价值。但由于中医药学的理论体系蕴含着我国古代朴素的哲学观，其含义古朴深奥，很难为现代医学体系所理解[1]。如何实现中医药的国际化是目前中药现代化进程中的重要课题。为使中药及其制剂为国际医药市场所接受，使中医药学具有现代科学理论支撑，基于中药药效活性成分的中药现代化研究已成为一项长期战略部署[2]。我国国土幅员辽阔，蕴藏着丰富的天然药物资源，天然药物成分具有骨架多样，活性广泛，高效低毒等特点，因此从中寻找和开发新药已经成为现代新药研发的主导策略[3]。然而中药和天然药物具有复杂次生代谢产物，并且药效物质基础模糊，这增加了从中发现和寻找新药的难度[4]。近年来一些从复杂体系中发现和寻找活性成分的快速遴选方法已经迅速发展起来，本文对此进行综述，以期为天然来源药物活性成分遴选提供理论支撑和科学数据。

1 基于系统生物学的遴选技术

系统生物学是借助于实验、计算方法与系统论相整合，来研究生物系统的组成以及相互之间动态变化关系的学科[5]。其整体化思想，与中医药的“整体观”、“辩证观”、“动态观”完美契合。

1.1 代谢组学

代谢组学是探究生物体系受到外界刺激后其内源代谢物种类、数量及其变化规律的科学，可以从整体水平反映疾病治疗过程中的小分子代谢物的动态变化[6]。常采用1H-NMR，13C-NMR，HPLC-MS等技术，对实验动物的尿液、血清、血浆、组织、细胞及细胞内成分等样本进行综合检测[7]。目前代谢组学发展到更为精准的分析，对于细胞器代谢物的分析研究越发多样化，由于反向液相色谱不利于极性及离子性代谢成分的检测，阴离子交换色谱以及多色谱-质谱联用方法相继被开发用于复杂代谢产物的分析鉴定[8]。将靶向和非靶向技术的优点相结合，凭借新方法良好的分辨率和特异性，舒一崧等基于非靶向代谢组学技术，借助UHPLC-QE Orbitrap HRMS利用谱图匹配、碎片扫描、同为素识别等方法将目标聚焦到柑橘类中药枳实及细胞色素P450，进一步探究其对化学诱导肝损伤的保护作用[9]。

1.2 蛋白质组学

化学蛋白质组学已成为药物发现过程中表型遴选必不可少的手段[10]。Dai等[11]结合SILAC定量蛋白质组学，对黄芩苷(baicalin)给药后HeLa细胞内蛋白质的BP结合含量进行分析，联合生物信息对比分析后，聚焦到对baicalin不敏感的siCPT1A，随后进行体外酶学实验验证，黄芩苷通过激活CPT1A，加速脂肪酸降解。蛋白质组学优越性在于能够进行多靶点、高通量遴选，但在测定多种有机成分时不准确，会产生假阳性结果，核酸大分子也会对结果产生干扰，蛋白酶消化后，基于肽的蛋白质组学可能会错过全长天然蛋白质中存在的关键信息。

1.3 基因组及转录组学

基因组学及转录组学研究依托的基因芯片技术，其原理是将特定的寡聚核苷酸序列或cDNA片段固定于基片上，基于mRNA可能与特定基因的固定化靶序列的高密度阵列杂交，定性或定量检测杂交信号以获取相关的生物学信息[12]。基因芯片可以实现微量化、高内涵、高通量的遴选研究，为药物作用发现新的靶标，也为新药遴选及研发提供新策略。其优势在于在单次实验过程中，可以对基因进行高通量分析，具有快速、高特异性的优越性[13]。周威等人依据人颈动脉正常组织及粥样硬化和的基因表达数据，遴选出差异基因，发现复方丹参滴丸中有10个成分与药物分子结构相似[14]。但基因芯片技术由于配套设施昂贵，获得的结果存在假阳性、操作复杂、重复性差、分析泛围狭窄，限制了其应用。

2 基于靶标的遴选技术

药靶是指在疾病的病理过程中发挥某种作用的生物大分子，某种疾病的靶标被确认后，便可基于此来进行药物遴选。早期药物研发多以病原微生物为靶标，进而发现了抗生素，随着研究水平不断深入，分子生物学技术蓬勃发展，大量与疾病相关的受体和酶被发现，使药靶的发现上升到分子水平[15]。因此基于受体-配体之间的亲和作用，基于靶分子与配体结合的原理，从复杂体系中分离潜在配体的垂钓技术得到不断革新[16]。目前该领域的技术如生物色谱，毛细管电泳，亲和超滤，平衡透析，微透析和磁性纳米垂钓等均广泛应用于中药活性成分遴选[17]。

2.1 亲和超滤法

亲和超滤是基于受体与配体特异性地结合的特性，将具有潜在配体的复杂体系与靶标大分子混合后，利用超滤膜对不同大小物质选择透过性，截留有亲和作用的配体，将截留下来的复合物通过使靶标大分子变性的方法，释放出结合的配体[18]。亲和超滤法应用范广，设备低廉，操作简单，具有新颖性、高特异性和普适性，方法不足之处在于由小分子与超滤膜的非特异性结合产生假阳性结果[19]。本课题组将亲和超滤质谱法与在线清除自由基检测技术相结合，同时对栀子中的MPO抑制剂和次氯酸清除剂进行遴选研究得到藏红花酸衍生物作为栀子中MPO抑制剂，发现清除次氯酸的有效成分为喹啉酸衍生物及环烯醚萜苷类成分[20]。

2.2 平衡透析法

将靶标与配体溶液利用透析膜分隔开，建立浓度梯度，小分子以扩散压为动力，穿过透析膜与靶标大分子结合，平衡透析法无法直接准确检测与靶标结合的小分子，但通过检测未结合的小分子含量，可测定结合的配体数量[21]。该方法操作简便、装置价格低廉、结果直观。高迪等[22]采用平衡透析法，利用脂质体生物膜遴选中成药脊痛宁片中的活性成分，发现了9个活性成分。但此方法不足之处在于获取结果单一，低通量，需要色谱、光谱技术和热力学分析等方法进行辅助解析。

2.3 毛细管电泳法(CE)

目前毛细管电泳法已成为一种通用、有效的微量分离技术[23]。该法操作简单，样品消耗少，分析时间短。Li等[24]报道了用CE结合HPLC-MS/MS遴选天然产物中表皮生长因子受体抑制剂的方法，对39种天然产物进行了研究。但毛细管电泳法检测小分子时不稳定，重现性差。

2.4 生物反应器

生物反应器是模拟酶或其它微生物的功能，在体外进行生化反应的装置[25]。Zhao等[26]利用三维细胞生物反应器结合高效液相色谱-光谱法培养3D细胞生物反应器遴选朱砂七提取物中的生物活性成分。但生物反应器的不足之处在于其制作费时费力，尚无标准化，商品化。

2.5 生物色谱技术

生物色谱技术是将生物活性材料如受体、酶、细胞膜或细胞等与色谱载体固着后作为固定相，利用活性成分与靶标特异性结合的原理，结合色谱技术的分离特点发展而成的新型活性成分遴选技术[27]。生物色谱法已成功应用于中药活性成分的发现研究中[28]。Chen等[29]比较了用脂质体膜、红细胞膜和心肌细胞膜与丹参化合物相互作用前后色谱图，鉴定出12种可渗透的丹参化合物并证明其具有生物活性。生物色谱技术可以从复杂基质中进行活性成分的遴选，分离和阐明活性成分的结构[30]。该法不足之处在于色谱柱制备成本高、寿命短、传质限制、活性降低、无法模拟人体环境因此而导致活性成分的漏遴[27]。

2.6 磁性配体垂钓

在配体垂钓的研究领域，配体垂钓效果随着垂钓材料的发展不断进步革新。目前研究最集中、应用最广泛的配体垂钓材料就是磁性材料。依据磁性颗粒的大小可分为磁性纳米粒子和普通磁性材料。磁性纳米粒子在磁性材料中有着的独特的优势：超顺磁性，这得益于磁性纳米颗粒纳米级别的粒径，因此便于表面修饰来键合用于垂钓的靶标大分子，一般通过共价键来键合诸如酶、受体、抗原等靶标大分子[31]。Sileshi G Wubshet等[32]提出了一种生物分析平台，结合磁性配体捕获α-葡萄糖苷酶抑制谱和HPLC-HRMS-SPE-NMR，用于直接从粗植物提取物中鉴定α-葡萄糖苷酶抑制配体，成功鉴定了杨梅素3-O-α-L-鼠李糖苷，杨梅素，槲皮素和山奈酚作为α-葡糖苷酶抑制配体。然而除了酶这类生物大分子之外，有研究者利用磁性纳米粒子上固定细胞膜的方法来进行配体垂钓。Tang等[33]首次将细胞膜包被的磁珠用于配体垂钓，利用红细胞膜包被的磁珠从天然产物检测潜在的活性成分，例如欧前胡素。

2.7 分子对接

锁钥模型和诱导契合学说是分子对接的基本原理，前者基于受体配体均为刚性结构的基础，后者基于受体配体均为柔性结构，对接结果更加准确[34]。分子对接的方法分为刚体对接、半柔体对接及柔体对接，药物发现过程中利用该方法完成姿势预测，虚拟遴选和结合亲和力估计的目的[35]。

目前，分子对接已广泛应用于中药活性成分的遴选中。中药化学数据库(TCMD)和中国天然产物数据库(CNPD)已被成功开发并应用于先导化合物的设计，成为虚拟遴选的可靠武器[36]。Gao等[37]基于多受体-配体复合物的实验结合结构建立了基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抑制剂的药效团模型，结合药效团模型与分子对接进行虚拟遴选，从天然产物数据库中发现四种新型MMP-9抑制剂。该技术目前也被应用于复方的活性成分虚拟遴选中。徐青青等[38]构建了六味地黄方中己知的21种主要化学成分及代谢产物结构配体分子库，采用虚拟遴选技术分析了六味地黄方中抑制α-葡萄糖苷酶的有效物质。发现2种四环三萜类化合物结合能较低，成功推测了六味地黄方治疗2型糖尿病的活性成分。当前对高度灵活配体的对接预测不太可靠，仍有一些理论和计算方面的挑战需要克服。

3 基于成分本身的遴选技术

3.1 网络药理学

传统的药物发现模式是设计精选作用于个体药物靶标的最合适配体。然而与多靶点药物相比，精选的化合物可能表现出低于预期的临床效果。整合网络生物学和多向药理学有望扩大目前中药活性成分的空间[39]。Tang等[40]研究了用于治疗过敏性鼻炎的复方：麻黄附子细辛汤，利用网络药理学方法，发现了四种预测成分具有抗炎作用。网络药理学的研究过程中，优化多种活动的同时平衡类似药物的特性并控制不脱靶是一项艰巨的任务[39]。

3.2 血清药物化学

基于入血成分可能是中药有效成分这一假说，血清药物化学研究采用中药口服给药后采集血清样品，从血清中分离、鉴定移行成分的方法[41]。陈思通过血清药物化学、文本挖掘和相似性匹配相结合的方法鉴别出四逆汤抗心衰的48个潜在活性成分[42]。中药血清药物化学理论体系简单、技术成熟、设备普及、成本低廉。不足之处在适用于口服中药，有效成分需经过血液循环，灵敏度低，需要化学分离、活性测定等过程，周期长，通量性较差[43]。

4 结 语

基于新型技术手段建立快速、有效的遴选方法是从“天然组合化合库”中辨认、遴选药效活性成分及开发新药的前提。近年来，随着多学科交叉应用与融合，基于生物亲和作用的快速遴选模式不断涌现，多种技术的联合应用使中药药效活性成分的研究更高效率、高灵敏度、强特异性，进而在一定程度上为新药开发提供助力。