PI3K抑制剂TGX-221对人骨肉瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响

(深圳市第三人民医院骨科,广东 深圳 518000)

骨肉瘤是儿童及青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤，最常见于股骨远端、胫骨近端或肱骨，15%～20%的患者在诊断时会发现转移，特别是在肺和骨骼，且发展迅速[1]。典型的临床症状主要是受累骨骼的疼痛和肿胀。目前的治疗策略为术前化疗，然后手术切除原发肿瘤以及可检测的转移性肿瘤，再辅以术后化疗[2]。联合运用甲氨蝶呤、多柔比星和顺铂的多药物化疗方案可以改善患者的预后，未发生转移的患者5年生存率为65%～70%，已发生转移的患者5年生存率为19%～30%[3]。尽管随着手术方式的改进和化疗药物的联合应用，骨肉瘤患者的5年生存率获得了明显的提高，但进一步改善预后遇到了瓶颈，因此急需开发新的药物改善患者预后，进一步提高患者生存质量[4]。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是脂质激酶，充当中间信号分子，将来自细胞外刺激的信号转化为调节多种信号转导途径的细胞内信号。这些途径调节许多必需的细胞过程，包括细胞生长、分化、增殖、运动和新陈代谢等[5]。PI3K信号通路是癌症中最常见的失调途径之一，其在调节作为癌症特征的细胞过程(如细胞增殖、凋亡或迁移)中起主要作用。此外，在人类癌症中也经常观察到这些酶的激活突变，导致癌症生长。因此P13K途径已经成为抗癌药物开发的主要焦点[6]。TGX-221是一种高效的、选择性的PI3K p110β抑制剂，目前已经在包括胶质瘤、前列腺癌、肾透明细胞癌等肿瘤细胞中发挥抗肿瘤作用，但能否在骨肉瘤中发挥抗肿瘤作用依旧未知。本研究通过体外培养骨肉瘤U2OS和MG-63细胞，给予TGX-221干预，观察其作用及影响，初步探究TGX-221对骨肉瘤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TGX-221购自美国MCE公司，根据说明书用DMSO配置成5 μmol/L的工作液,置于-80 ℃长期保存；U2OS和MG-63细胞株购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自美国Gbico公司；DMEM高糖培养基、PBS、胰蛋白酶、青/链霉素购自上海吉诺生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自碧云天生物有限公司；凋亡试剂盒PE/7AAD购自美国BD公司；CCK8购自日本同仁公司；PI购自安特捷公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞U2OS和MG-63细胞用含10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM高糖培养基放置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。当细胞长至融合度达90%后用胰酶传代，实验选用处于对数生长期的细胞。

1.2.2 CCK8法检测TGX-221浓度梯度对细胞活力的影响 将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，1 000 r/min离心5 min后，用完全培养基(含10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM高糖培养基)轻轻冲悬，计数。将人U2OS和MG-63细胞种植入96孔板里，每个浓度梯度设置3组复孔，每孔加入200 μL的完全培养基培养过夜。第2天分别加入0、2.5、5、10、15、20、25 μmol/L的TGX-221，37 ℃培养48 h后弃培养基。重新加入100 μL含10 μL CCK8的完全培养基，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度(OD)值，实验重复3次。

1.2.3 CCK8法检测TGX-221作用时间对细胞活力的影响 将处于对数生长期的细胞消化，离心，计数后按照6×103/孔的密度将细胞种植到96孔板里，设置4个时间梯度(0 h、24 h、48 h、72 h)。分别在0 h、24 h、48 h、72 h测量对应梯度的OD值，绘制活性曲线。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 将处于对数生长期的U2OS和MG-63细胞用胰酶消化，离心后冲悬。设置实验组和对照组，把相同数目的细胞接种于6孔板培养24 h，然后弃培养基，用PBS清洗2遍后加入不含血清的高糖培养基，置于37 ℃培养箱继续培养。24 h后弃培养基，重新加入完全培养基，实验组加入10 μmol/L的TGX-221，对照组则加入相同剂量的DMSO。孵育24 h后用胰酶消化，离心，PBS清洗后再次离心，然后加入-20 ℃预冷的70%乙醇4 mL，震荡冲悬后放置于-20 ℃固定过夜。第2天离心，用PBS清洗2遍后加入500 μL的PBS和10 μL的RNA酶，置于37 ℃水浴锅温浴30 min。然后加入10 μL的碘化丙啶(PI)，避光孵育20 min后上机测试。用ModFit LT 4.1软件分析细胞周期。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将处于对数生长期的细胞种植到6孔板里，待细胞长到融合度为60%的时候在实验组里面加入TGX-221，使得培养浓度为10 μmol/L。对照组里则加入相同剂量的DMSO，放置于37 ℃的培养箱孵育24 h。收集培养基，用不含EDTA的胰酶消化，离心并用PBS清洗残留的培养基。然后加入1 mL稀释为1×的Binding Buffer，冲悬细胞并转移到流式管里。每管细胞各加入5 μL的PE和7-AAD，避光室温孵育10 min后上机测试。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 TGX-221可以有效抑制U2OS和MG-63细胞的增殖

结果显示，随着TGX-221作用浓度的增加，450 nm波长处的OD值逐渐减小；随着作用时间的延长，对照组和实验组之间的OD值差距愈发变大，对照组显示出更强的增殖能力，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

a、b：TGX-221以剂量依赖性的抑制U2OS和MG-63细胞的增殖；c、d：TGX-221呈时间依赖性抑制U2OS和MG-63细胞的增殖

* ：与实验组比较，P<0.05； #：与实验组比较，P<0.01

图1 TGX-221对人骨肉瘤U2OS和MG-63细胞增殖的影响

2.2 TGX-221阻滞U2OS和MG-63细胞的细胞周期于G1期

结果显示，在人骨肉瘤U2OS和MG-63细胞系中，实验组中处于G1期的的细胞比例高于对照组，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；同时，实验组中处于G2期和S期的细胞比例也有不同程度的下降，表明TGX-221可以阻滞人骨肉瘤细胞的周期进展(图2)。

2.3 TGX-221诱导U2OS和MG-63细胞凋亡

流式细胞术结果显示，与对照组相比，实验组加入TGX-221处理24 h后的细胞凋亡比例增加，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明TGX-221能够通过诱导人骨肉瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用(图3)。

a、b：TGX-221将人骨肉瘤U2OS细胞阻滞于G1期;c、d：TGX-221将人骨肉瘤MG-63细胞阻滞于G1期 #：与对照组比较，P<0.01

a、b：TGX-221诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡; c、d：TGX-221诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡 *：与对照组比较，P<0.05

3 讨论

骨肉瘤是世界上最常见的原发性骨恶性肿瘤，起源于骨骼系统的结缔组织，尤其好发于多发性骨髓瘤患者[7]。骨肉瘤大约占所有癌症的6%和儿童及青少年恶性骨癌病例的56%。目前通常采取多种方式联合治疗，包括最大限度的手术切除、辅助化疗与保肢重建手术。由于化疗的引入和肿瘤的手术切除，局部骨肉瘤患者的5年生存率有了显著提高[8-11]。然而，常规化疗也存在不少缺点，例如化疗药物往往对正常组织具有高毒性，易导致贫血、中性粒细胞减少、血小板减少、心脏损伤等一系列不良反应[12]。此外，骨肉瘤化疗还需面临的一大障碍是化疗药物的交叉性耐药，多药耐药基因MDR1编码的P-糖蛋白(P-gp)通过将细胞内药物逆浓度梯度运出细胞外，使细胞内药物浓度不断下降而达不到有效杀伤浓度，从而产生耐药性。因此，新药物的开发具有十分重要的意义[13]。

PI3K的雷帕霉素/AKT/哺乳动物靶蛋白(mTOR)途径在包括骨肉瘤在内的许多肿瘤中被过度激活，是肿瘤进展和化疗抗性的一个重要因素。PI3K是由p85和p110催化亚基组成的异二聚体，是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)下游的主要信号传导组分，PI3K激活其下游Akt，其磷酸化影响下游多种底物，涉及多种细胞过程，包括细胞生长、增殖、凋亡和代谢，这些过程对肿瘤发生和进展至关重要。目前已开发出许多靶向该途径的药物，TGX-221就是其中之一，是一种高效的PI3K p110β抑制剂[14-16]。Yang等[17]研究证实，TGX-221可以抑制人胶质母细胞瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。Chen等[18]研究发现,TGX-221可以阻断裸鼠中前列腺癌的异种移植肿瘤生长。这些研究表明，TGX-221可能是一种潜在的抗肿瘤药物，但目前在骨肉瘤中能否发挥抗肿瘤作用和可能的抗肿瘤机制仍不清楚。本研究旨在探究TGX-221对人骨肉瘤细胞系U2OS和MG-63细胞的增殖、细胞周期和凋亡的影响，为未来可能进行的临床试验提供理论依据。

恶性肿瘤最主要的特征就是无限增殖、永生化，因此抑制肿瘤细胞的恶性增殖是药物研发的关键。本研究设置了0、2.5、5、10、15、20、25 μmol/L共7个浓度，探究骨肉瘤细胞随着TGX-221作用浓度增加的活性变化。结果显示，随着作用浓度的增加，测量出的OD值逐渐降低，表明TGX-221可以剂量依赖性地抑制骨肉瘤细胞的增殖。同时，本研究设置了时间梯度，选择10 μmol/L作为实验浓度，分别测量骨肉瘤细胞在 0 h、24 h、48 h、72 h的OD值。结果显示，与对照组相比，实验组的OD值增加缓慢，且与对照组之间的OD值差距愈发增大，表明TGX-221可以有效地抑制人骨肉瘤U2OS和MG-63细胞的增殖。

细胞周期分为G1期、S期、G2期和M期。G1期是DNA复制前期，主要是为DNA的复制做准备；S期又称DNA合成期；G2期主要为有丝分裂做准备；M期即有丝分裂期。G1期被认为是启动细胞周期的关键时期，恶性肿瘤发生的一个核心事件是正常的细胞周期失去调控，导致肿瘤细胞可以无限增殖。本研究探究了TGX-221对U2OS和MG-63细胞周期的影响，结果显示，与对照组相比，实验组处于G1期的细胞比例增加，表明TGX-221可阻滞细胞周期于G1期，这些细胞逐渐失去增殖能力，不再分裂，日趋衰老。这类细胞结构和功能发生高度分化，对肿瘤增殖没有作用，因此G1期细胞所占数量越多，肿瘤的恶性程度越低[19]。

肿瘤的生长取决于增殖与凋亡之间细胞的平衡状态，化疗药物就是通过诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[20]。我们在研究前期证实了TGX-221在体外抑制骨肉瘤细胞的增殖和诱导细胞周期阻滞。因此，我们进一步探究了TGX-221对骨肉瘤细胞凋亡的作用，结果表明，TGX-221可在体外促进骨肉瘤细胞的凋亡。

综上，本研究在骨肉瘤细胞中证实，TGX-221可以抑制U2OS和MG-63细胞增殖，阻滞细胞周期于G1期并诱导细胞凋亡。因此我们推测，TGX-221通过将大量的骨肉瘤细胞阻滞于G1期，抑制骨肉瘤细胞从G1期向S期转换，使得骨肉瘤细胞失去了增殖能力，引起细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。