杜仲籽油脂质体的制备及其稳定性研究

陈 亮，詹桂萍，鲁 颖，李加兴，余 佶，麻成金，姚茂君*

(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学 食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)又名思仙、思仲，传统以皮入药，在我国已有2 000多年的药用历史[1]。近年来，研究发现杜仲的叶、枝条、果实、雄花与皮含有相似的活性成分，均可入药[2]。此外，杜仲翅果中富含油脂[3]，其α-亚麻酸高达61.04%[4]，不仅能增强免疫力、抗炎、抗癌，而且还具有降低血压、调节血脂、抗抑郁、预防心脑血管疾病和延缓衰老等功效[5-6]。由原卫生部和国家卫生计生委发布的2009年12号公告中，批准杜仲籽油为新食品原料，故其可作为药食兼用油。然而杜仲籽油易氧化“酸败”，生成过氧化脂质，限制了其在食品工业上的应用。脂质体是脂类分子在低剪切力作用下与水混合形成的一种球状囊泡[7]。作为一种纳米运输载体，脂质体不仅可以克服疏水性物质水溶性差及生物不稳定性的缺点，从而增强其稳定性、防止氧化分解，而且还可以提高水溶性，促进活性物质的吸收[8]。制备脂质体的传统方法包括薄膜水化法[9]、逆向蒸发法[10]、乙醚注入法[11]和复乳法[12]等，尽管这些方法制备的脂质体包埋率高，但存在有机溶剂残留、耗时长、产品粒径大和稳定性不佳等缺点。乙醇注入-超声波法是将磷脂等脂质膜材和脂溶性活性物质一起溶于无水乙醇中，用注射器加压将溶液快速注入到水相中，减压旋转蒸发除去乙醇，再经超声波处理形成脂质体的方法，操作简单、耗时少且无毒副作用。鉴于此，本研究采用乙醇注入-超声波法制备杜仲籽油脂质体，以包埋率为指标对制备工艺进行优化，并考察杜仲籽油脂质体的稳定性，以期提高杜仲籽油的氧化稳定性及储藏时间，为杜仲籽油在功能性食品中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂及仪器

杜仲籽油，由湘西自治州和益生物科技有限公司提供。大豆卵磷脂(纯度≥97%)、β-谷甾醇，上海瑞永生物科技有限公司；吐温-80，成都金山化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、石油醚(沸程60～90 ℃)，均为国产分析纯。

JY-ⅡDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物公司；UV-2450紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；Talos F200x场发射透射电子显微镜，赛默飞世尔公司；Nano-ZS90激光粒度分析仪，英国马尔文公司；TDL- 40B低速离心机，上海安亭科学仪器厂；ZDJ- 4A型自动电位滴定仪，上海仪电科学仪器公司。

1.2 杜仲籽油脂质体制备工艺优化

1.2.1单因素试验 采用乙醇注入-超声波法制备杜仲籽油脂质体。准确称取大豆卵磷脂240 mg，与一定比例的β-谷甾醇、杜仲籽油和吐温-80于无水乙醇中混合，在水浴振荡器中振荡，待其充分溶解后，用无菌注射器将脂质溶液注入到磷酸盐(PBS)缓冲液中。然后将样品溶液重新转移到圆底烧瓶中，水浴真空旋转蒸发除去乙醇，将所得乳液进行超声波处理，直至形成均匀脂质体乳液。

分别考察大豆卵磷脂与β-谷甾醇质量比(2 ∶1～10 ∶1)、大豆卵磷脂与杜仲籽油质量比(2 ∶1～6 ∶1)、吐温-80用量(10%～30%，以大豆卵磷脂质量计)、PBS缓冲液pH值(6.0～8.0)、超声波作用时间(5～25 min)、超声波功率(60～300 W)等对杜仲籽油脂质体包埋率的影响。

1.2.2Plackett-Burman试验 在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计方法，考察上述6个因素(n=12)对杜仲籽油脂质体包埋率的影响，并筛选出显著影响因素。

1.2.3最陡爬坡试验 通过Plackett-Burman试验得到的一次拟合方程，设计各显著因素的爬坡方向和步长，确定各显著因素的最佳中心点。

1.2.4响应面试验设计及分析 采用Box-Behnken试验设计，优化上述对包埋率影响显著的因素，通过二次多项式回归拟合，结合方差分析及各因素交互作用，确定杜仲籽油脂质体制备最佳工艺条件。

1.2.5数据处理 使用Design-Expert8.0.6软件对数据进行描述和多元回归分析。

1.3 杜仲籽油脂质体包埋率的测定

1.3.1标准曲线的绘制 将杜仲籽油、大豆卵磷脂、β-谷甾醇分别溶解于石油醚中，以石油醚为空白对照，在200～400 nm波长范围内扫描，获得最大吸收波长为302 nm。配置质量浓度梯度为1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 g/L的杜仲籽油石油醚溶液，在302 nm处测定不同浓度杜仲籽油石油醚溶液的吸光度。以质量浓度为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)，得标准曲线方程为y=0.104 8x-0.003 4，R2=0.993 1。

1.3.2包埋率的测定 参照文献[13]方法并稍做修改测定杜仲籽油脂质体包埋率。取10 mL脂质体于烧杯中，加入10 mL石油醚，混合均匀，4 000 r/min离心15 min，取上层石油醚液置于25 mL容量瓶，重复萃取2次后，合并石油醚液，并用石油醚定容至刻度，以石油醚为空白对照，在302 nm 处测定样品吸光度(A0)。选用10%Triton X-100甲醇溶液为破乳剂，超声波破乳(功率96 W，10 min)，同法测定上述萃取后的脂质体溶液的吸光度(A1)。将A0和A1分别代入标准曲线方程，计算出游离杜仲籽油质量浓度(C0)和被包埋的杜仲籽油质量浓度(C1)，并计算包埋率(η)：η=C1/(C0+C1)×100%。

1.4 杜仲籽油脂质体的形态与性能分析

1.4.1微观形态观察 采用负染色法[14]观察脂质体的表面形态。用PBS缓冲液将样品稀释10倍，用铜网沾取少量脂质体悬浮液，在铜网上停留2 min，然后将铜网浸入2%磷钨酸2 min，并用滤纸吸干，在透射电镜下观察杜仲籽油脂质体的微观形态。

1.4.2粒径测定 按优化工艺条件制备杜仲籽油脂质体悬浮液，稀释一定倍数后，在25 ℃、散射角90°条件下，采用激光粒度仪测定杜仲籽油脂质的粒径大小、多分散系数(PDI)及Zeta电位值。

1.4.3稳定性分析 按优化工艺条件制备杜仲籽油脂质体悬浮液，分装于密封小瓶中，分别置于4、25和40 ℃条件下避光保存15 d，每隔3 d取样观察1次。根据平均粒径、包埋率、pH值、丙二醛(MDA)含量等指标的变化情况，评价其储藏稳定性。其中以MDA含量表征杜仲籽油脂质体中磷脂的氧化程度，参照文献[15]方法，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。

2 结果与分析

2.1 杜仲籽油脂质体制备条件的优化

2.1.1单因素试验结果分析 选择大豆卵磷脂与β-谷甾醇质量比(X1)、大豆卵磷脂与杜仲籽油质量比(X2)、吐温-80用量(X3)、PBS缓冲液pH值(X4)、超声波作用时间(X5)和超声波功率(X6)为考察因素，探讨各因素对杜仲籽油脂质体包埋率的影响，结果见图1。

a.m(大豆卵磷脂)/m(β-谷甾醇)m(phosphatidylcholine)/m(β-sitosterol); b.m(大豆卵磷脂)/m(杜仲籽油)

由图1(a)可知，β-谷甾醇含量过高过低都会导致杜仲籽油脂质体包埋率下降，大豆卵磷脂与β-谷甾醇最佳质量比为2 ∶1～6 ∶1，考虑到Plackett-Burman试验设计因素的水平选取时，需尽量涵盖每个因素允许取值的最大空间，但不能选太大，所以选择大豆卵磷脂与β-谷甾醇最佳质量比为3 ∶1～5 ∶1。同理，由图1(b)～图1(f)可知，大豆卵磷脂与杜仲籽油的质量比、吐温-80用量、PBS缓冲液pH值、超声波作用时间、超声波功率分别在3 ∶1～5 ∶1、15%～25%、6.8～7.2、6～14 min、160～240 W区间内杜仲籽油脂质体包埋率达最高。

2.1.2Plackett-Burman试验设计筛选关键因素 在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计方法，考察了上述因素对杜仲籽油脂质体包埋率的影响，并筛选出显著影响因素，每个因素取最低(-1)和最高(1)两个水平。PB试验设计方案及结果见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计及结果

根据表1试验设计结果，进行多元回归方程拟合和方差分析，得一次回归方程：Y=0.348 5+1.648×10-2X1+6.667×10-3X2-1.500×10-4X3+3.850×10-2X4-2.079×10-3X5-1.567×10-4X6，对方程进行方差分析及显著性检验，结果见表2。

表3 最陡爬坡试验设计及结果

2.1.3最陡爬坡试验确定最佳中心点 根据Plackett-Burman试验回归方程中3个显著因素(X1、X4、X5)的变量关系确定爬坡方向和步长，其中X1、X4为正效应，应当取其高水平；X5为负效应，应当取其低水平。最陡爬坡试验设计及结果见表3。由表3可知，杜仲籽油脂质体包埋率在第2组达到最高，说明第2组附近存在最优点。因此以m(大豆卵磷脂)/m(β-谷甾醇)3.5 ∶1、PBS缓冲液pH值6.9、超声波作用时间12 min为响应面试验中心点，进行响应面优化。

2.1.4响应面优化分析 结合单因素试验、PB试验及最陡爬坡试验结果，采用Box-Behnken试验设计3因素3水平共17组试验，响应面试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

根据表4试验结果，进行多元回归方程拟合和方差分析，得到自变量的二次多项回归方程：Y=-128.6+1.617X1+36.14X4+0.356 1X5-0.197 0X1X4-4.850×10-3X1X5-3.138×10-2X4X5-3.361×10-2X12-2.548X42-5.057×10-3X52。

根据模型回归方程求得杜仲籽油脂质体制备的优化工艺条件为大豆卵磷脂与β-谷甾醇比为3.1 ∶1，PBS缓冲液pH值为6.93，超声波作用时间为12.52 min，在此条件下杜仲籽油脂质体的理论包埋率为74.41%。

表5 回归方程方差分析

为验证该响应面结果的可靠性，在此条件下进行3次验证实验。采用上述最佳工艺制备脂质体，考虑实际情况，取大豆卵磷脂240 mg,设定大豆卵磷脂与β-谷甾醇质量比为3.1 ∶1，大豆卵磷脂与杜仲籽油质量比为4 ∶1，吐温-80占大豆卵磷脂质量分数为20%，PBS缓冲液pH值为6.9，超声波作用时间13 min，超声波功率180 W，制备的杜仲籽油脂质体平均包埋率为75.26%，与理论值的相对误差为1.129%，与刘玉珍等[8]通过乙醇注入-超声波法制备的薏苡仁油脂质体包埋率接近，说明该模型真实可靠。

2.2 杜仲籽油脂质体微观形态及粒径分布

按上述优化工艺条件制备杜仲籽油脂质体悬浮液样品于透射电镜下观察粒子微观形态，结果见图2。由图2可知，杜仲籽油脂质体外观呈现准球形，平滑完整，无明显塌陷和凝聚成团的现象。经超声波处理后，杜仲籽油脂质体颗粒分布较为均匀，粒径小于100 nm。

采用粒径分析仪测定杜仲籽油脂质体的粒径分布，结果见图3。由图3可知，杜仲籽油脂质体的平均粒径为137.4 nm，分布均匀，且呈正态分布。此外，经测定杜仲籽油脂质体的平均Zeta电位为-19.3 mV，PDI为0.219，初步判断所制备的杜仲籽油脂质体稳定性良好。

由上述分析可知，透射电镜与粒径分析仪测定的粒径结果稍有差异，这可能是因为粒径分析仪所测的杜仲籽油脂质体是液体状态，测的是水力学粒径，使得所测粒径较大；与此相反，透射电镜图是在样品脱水条件下测得的[16]。此外，2种测定方法的分析技术原理有所差异，激光粒度分析仪对颗粒粒径的计算基于颗粒的扩散特性，体系的黏度会对结果产生干扰[17]。

2.3 杜仲籽油脂质体的稳定性分析

通过测定包埋率、平均粒径、pH值和MDA含量，分析杜仲籽油纳米脂质体的储藏稳定性。在不同储藏温度下，杜仲籽油脂质体包埋率变化趋势如图4(a)所示。由图可知，温度越高，杜仲籽油渗出越严重，包埋率越低；在4 ℃条件下，储藏15 d时包埋率由75.26%下降到61.45%，下降趋势相对于25和40 ℃明显放缓。这可能是因为随着温度的升高，脂质体膜材的分子热运动加速，脂质双分子层的酰基侧链从有序排列到无序，导致脂膜由凝胶态转变为液晶态，膜的横切面增加，双分子层的厚度减小，膜流动性增加，导致包埋的杜仲籽油泄露[18]。

由图4(b)可知，在4 ℃条件下，储藏15 d时杜仲籽油脂质体悬浮液pH值略微下降，而25和40 ℃条件下储藏15 d时pH值下降明显。这是由于随着温度的升高，加重了磷脂的氧化程度，使其水解产生游离脂肪酸、溶血磷脂和甘油磷脂等[19]，这些产物的生成，导致杜仲籽油脂质体在储藏过程中pH值下降，并加速其进一步水解和氧化。

由图4(c)可知，在4 ℃下，随着储藏时间的延长，脂质体的粒径呈先增大后减小的趋势，到第9天时粒径由137.4 nm上升到187.8 nm，在第15天时粒径下降到160.9 nm。在25和40 ℃下，脂质体的粒径也呈同样的趋势，且随着温度的升高，脂质体前期粒径增大更加明显。这是因为脂质体是热力学不稳定系统，在储藏过程中受体系温度影响较大，磷脂膜之间易发生融合、聚集等现象，导致粒径变大；此外，随着杜仲籽油的泄露与水解，游离脂肪酸的生成可以充当良好的融合剂的作用，促进脂质体融合[20]。但随着时间的推移，脂质体膜可能会由于氧化而发生崩解，脂质体变成碎片，导致所测平均粒径变小[21]。

a.包埋率encapsulation efficiency; b.pH值pH value; c.平均粒径particle size;d.MDA

由图4(d)可知，丙二醛(MDA)含量在储藏期间呈现先上升后趋于平缓甚至略有下降趋势，且4 ℃下脂质体的MDA含量低于25和40 ℃下的测定值。4 ℃下储藏15 d时，丙二醛由0.023 2 mg/g上升到0.033 1 mg/g。这是因为脂质体氧化过程通常是一个连锁式反应，丙二醛只是氧化反应的一个中间产物，在高温、低pH值、氧气等条件下会加速脂质体氧化水解[22]，此时，过氧化物分解速度低于生成速度，导致所测MDA含量加速升高；但随着储藏过程中氧气的损耗，使脂质氧化水解速度下降，随着过氧化物含量的升高，其分解速度加快，导致MDA含量上升平缓甚至下降[23]。

综上可知，杜仲籽油脂质体作为一个热不稳定体系，在4、25和40 ℃储藏15 d时，发现4 ℃下各项指标稳定性均优于25和40 ℃，4 ℃下的杜仲籽油脂质体有较好的储藏稳定性。

3 结 论

3.1采用乙醇注入-超声波法制备杜仲籽油脂质体，以杜仲籽油脂质体包埋率为响应值，在单因素的基础上，通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面试验得到杜仲籽油脂质体的最优制备工艺为：大豆卵磷脂240 mg,大豆卵磷脂与β-谷甾醇质量比为3.1 ∶1，大豆卵磷脂与杜仲籽油质量比为4 ∶1，吐温-80用量为20%，PBS缓冲液pH值为6.9，超声波作用时间13 min，超声波功率180 W。此时，杜仲籽油脂质体包埋率为75.26%。

3.2在优化工艺条件下，杜仲籽油脂质体在透射电镜下呈准球形，外观平滑完整，平均粒径为137.4 nm，PDI为0.219，Zeta电位为-19.3 mV。在4、25和40 ℃储藏15 d时，发现杜仲籽油脂质体在 4 ℃ 下有较好的储藏稳定性，其各项指标稳定性均优于25和40 ℃。