胞质Ca2+参与外源H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发

刘建新 欧晓彬 王金成

(甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室/陇东学院生命科学与技术学院,庆阳 745000)

种子萌发是作物生活周期的开始，也是抵御环境胁迫最为脆弱的阶段。裸燕麦(Avenanuda)禾本科(Gramineae)燕麦属(Avena)一年生杂粮作物，在我国北方广泛种植，土壤较高的盐碱含量成为其种子萌发和成苗的重要胁迫因素[1]。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)是近几年在植物体内发现的一种新型气体信号分子，它参与植物生长发育和逆境响应调节。如H2S作为下游信号与生长素共同诱导番茄(Lycopersiconesculentum)侧根的形成[2]，维持盐胁迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)胞内K+/Na+平衡[3]，通过减轻光抑制增强黄瓜(Cucumissativus)幼苗的耐冷性[4]等。外源H2S在植物种子萌发过程中发挥着重要的调控作用。研究表明，外源H2S通过提高β-淀粉酶活性促进小麦(Triticumaestivum)种子萌发[5]并提高干旱胁迫下小麦萌发苗存活率[6]；外源H2S还通过促进种子吸胀和提高活性氧清除能力缓解干旱对水稻(Oryzasativa)种子萌发的抑制[7～8]；并促进铜胁迫小麦萌发种子淀粉酶和酯酶活性[9]；激活盐胁迫下苜蓿种子萌发过程中抗氧化酶同工酶活性和提高相应转录物水平[10]。然而，H2S调控植物种子萌发对逆境响应的信号传导机制目前尚不十分清楚。

钙离子(Ca2+)作为第二信使，参与植物对逆境响应的调节。植物遭受盐胁迫时质膜Ca2+/H+反向转运蛋白表达增强[11]，导致细胞溶质Ca2+浓度改变[12]，并通过钙调蛋白级联传导调控细胞的分裂和伸长[13]。有研究表明，Ca2+和H2S通过调控重金属离子转运蛋白增强谷子(Setariaitalica)对铬胁迫的耐受性[14]；Ca2+还参与H2S调控的烟草(Nicotianatabacum)耐热过程[15]及盐碱胁迫下NO和H2O2对植物种子萌发的促进[16～17]。H2S在调控植物逆境响应过程中与NO、H2O2、Ca2+等信号存在相互作用，如H2S作为H2O2的上游信号促进绿豆(Vignaradiata)种子的萌发[18]等。那么，盐碱胁迫下H2S能否缓解对作物种子萌发的抑制，胞质Ca2+是否参与这一过程，目前尚未见报道。本研究以裸燕麦为材料，模拟其在甘肃栽培地的盐碱环境，探讨胞质Ca2+对H2S调控盐碱胁迫下种子萌发的影响，旨为揭示H2S调控种子萌发机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试裸燕麦品种为“定莜9号”(种子购自甘肃省定西市农业科学研究院)。H2S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)、胞外Ca2+螯合剂乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid,EGTA]、质膜Ca2+通道阻断剂氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)、液泡Ca2+释放抑制剂钌红(ruthenium red,RR)和内质网钙泵阻断剂毒胡萝卜素(thapsigargin,Thaps)均为美国Sigma公司产品。参考文献[16～17,19]及预实验筛选，所用EGTA、LaCl3、RR和Thaps浓度分别为5 mmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2 mmol·L-1和15 μmol·L-1。模拟甘肃省中部裸燕麦种植地盐碱组成，按NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3摩尔比为12∶8∶1∶9配制不同浓度的盐碱混合溶液。

1.2 种子发芽试验

1.2.1 盐碱胁迫浓度和NaHS浓度筛选

挑选100粒裸燕麦健康种子，均匀摆放在直径120 mm的培养皿中，滤纸作萌发床，分别加入6 mL浓度为15、30、45、60、75 mmol·L-1的盐碱混合溶液或100、200、400、600、800、1 000 μmol·L-1的NaHS溶液，以加等量蒸馏水作对照，在培养箱中20℃培养，3次重复。以胚芽突破种皮2 mm为发芽标准，每隔12 h统计发芽数，共统计7 d。筛选适宜的盐碱胁迫浓度和促进种子萌发的NaHS浓度。

1.2.2 盐碱胁迫、NaHS和胞质Ca2+抑制剂交叉试验

以筛选的盐碱胁迫浓度溶液、NaHS浓度溶液与LaCl3、EGTA、RR、Thaps进行单一或交叉处理，蒸馏水作对照，用1.2.1发芽方法观察对裸燕麦种子萌发的影响，重复3次。

发芽试验7 d结束后测量胚根、胚芽长度和各自干重，方法见文献[17]。然后分别计算发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率。

发芽势(%)=发芽前3 d种子发芽数/供试种子数×100

(1)

发芽率(%)=发芽7 d后种子发芽数/供试种子数×100

(2)

发芽指数(GI)=∑Gt/Dt

(3)

式中：Gt为t天的种子发芽数；Dt为相应发芽天数。

活力指数(VI)=GI×S

(4)

式中：S为胚根和胚芽干重之和。

平均发芽速率(GV)=∑(D·n)/∑n

(5)

式中：D为种子置床起的天数，n为相应各天发芽的种子数。

1.3 数据计算与统计分析

为综合评价不同处理对种子萌发的影响，用公式U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长的隶属函数值：

U(Xi)，i=1,2,3,…,n

(6)

式中：Xi为发芽指标值；Xmin和Xmax为不同处理下相应发芽指标的最小值和最大值。

每一发芽指标的权重应用客观赋权法进行计算：

Ij=Sj/Cj

(7)

式中：Ij是一个无量纲数；Sj是不同处理某一发芽指标的隶属函数值U(Xi)；Cj是对照组某一发芽指标隶属函数值U(Xi)的均值。

最后通过归一化计算出每个发芽指标的权重Wj=Ij/∑Ij，隶属函数综合评价值D=[U(Xi)×Wj]。百分率数据均经反正弦平方根转换(y=arc sin[sqrt(x/100)])，采用SPSS 20.0软件对所有数值进行单因素方差分析，SSR法差异显著性检验(显著性水平α=0.05)。所有数据结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度盐碱胁迫对裸燕麦种子萌发的影响

随着盐碱胁迫浓度增大，裸燕麦种子萌发受到明显抑制，其发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长显著下降(表1)。与0 mmol·L-1对照相比，15 mmol·L-1盐碱胁迫除平均发芽速率外即引起其他发芽指标的显著下降，当盐碱浓度为75 mmol·L-1时发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长分别下降了87.4%、77.0%、89.3%、95.4%、83.0%、78.4%和44.2%。

表1 不同浓度盐碱胁迫对裸燕麦种子萌发的影响

注：同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

Note：Different letters in the same column indicate significant difference between treatments atP<0.05,the same as below.

图1 盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的隶属函数综合评价值 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。Fig.1 The comprehensive evaluation value of membership function for seed germination of naked oat under saline-alkali stress Different letters indicate significant difference at P<0.05,the same as below.

不同发芽指标对盐碱胁迫浓度的响应存在差异，为综合反映盐碱浓度对裸燕麦种子萌发的影响，采用隶属函数方法计算的上述发芽指标综合评价值D随盐碱浓度的变化如图1。从图1可知，与0 mmol·L-1对照相比，15 mmol·L-1盐碱胁迫引起D值显著降低38.5%； 30 mmol·L-1处理D值降幅达73.1%，且与15 mmol·L-1处理的D值差异显著；45～75 mmol·L-1处理的D值降幅为89.9%～97.9%。因此，选用30 mmol·L-1作为进一步实验的盐碱胁迫浓度。

2.2 不同浓度NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响

图2A显示，与0 μmol·L-1对照相比，100～1 000 μmol·L-1NaHS处理的裸燕麦种子萌发D值均有不同程度提高，其中200～800 μmol·L-1处理的差异显著，而1 000 μmol·L-1处理的D值显著低于200～800 μmol·L-1处理的D值并与100 μmol·L-1处理的D值差异不显著。因此，用100～800 μmol·L-1NaHS分别与30 mmol·L-1盐碱溶液共处理观察对种子萌发的影响。结果如图2B所示：100 μmol·L-1NaHS与盐碱溶液共处理(C处理)的D值显著高于单独盐碱溶液处理(B处理)，200、400和600 μmol·L-1NaHS与盐碱溶液共处理(D、E、F)的D值与单独盐碱溶液处理(B)或C处理的D值差异不显著，而800 μmol·L-1NaHS与盐碱溶液共处理(G处理)的D值则显著降低。表明外源H2S可缓解盐碱胁迫对裸燕麦种子萌发的抑制，其中100 μmol·L-1NaHS的效果最好。

图2 不同浓度NaHS(A)及NaHS与30 mmol·L-1盐碱溶液共处理(B)对裸燕麦种子萌发的影响 A.对照；B.盐碱胁迫；C.盐碱胁迫+100 μmol·L-1 NaHS；D.盐碱胁迫+200 μmol·L-1 NaHS；E.盐碱胁迫+400 μmol·L-1 NaHS；F.盐碱胁迫+600 μmol·L-1 NaHS；G.盐碱胁迫+800 μmol·L-1 NaHSFig.2 Effects of different concentrations of NaHS and the co-treatment of NaHS and saline-alkali solution(30 mmol·L-1) on seed germination of naked oatA.Control；B.Saline-alkali stress；C.Saline-alkali stress+100 μmol·L-1 NaHS；D.Saline-alkali stress+200 μmol·L-1 NaHS；E.Saline-alkali stress+400 μmol·L-1 NaHS；F.Saline-alkali stress+600 μmol·L-1 NaHS；G.Saline-alkali stress+800 μmol·L-1 NaHS

图3 EGTA对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响 A.对照Control；B.EGTA；C.NaHS；D.NaHS+EGTA；E.盐碱胁迫；F.盐碱胁迫+EGTA；G.盐碱胁迫+NaHS；H.盐碱胁迫+NaHS+EGTAFig.3 Effects of EGTA on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.EGTA; C.NaHS; D.NaHS+EGTA; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+EGTA; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+EGTA

2.3 EGTA对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响

与对照(A)相比，EGTA处理(B)使D值显著下降了22.9%。EGTA与NaHS共处理(D)的D值显著低于单独NaHS处理(C)；EGTA与盐碱胁迫共处理(F)的D值显著低于单独盐碱胁迫处理(E)。盐碱胁迫导致D值显著下降(E与A相比)，增添NaHS显著提高盐碱胁迫下的D值(G与E相比)，EGTA显著逆转NaHS提高盐碱胁迫下D值的作用(H与G相比)。EGTA是胞外Ca2+专一性螯合剂(图3)。上述结果表明，胞外Ca2+水平下降显著降低H2S对盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的促进作用。

图4 LaCl3对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响 A.对照；B.LaCl3；C.NaHS；D.NaHS+LaCl3；E.盐碱胁迫；F.盐碱胁迫+LaCl3；G.盐碱胁迫+NaHS；H.盐碱胁迫+NaHS+LaCl3Fig.4 Effect of LaCl3 on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.LaCl3; C.NaHS; D.NaHS+LaCl3; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+LaCl3; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+LaCl3

图5 RR对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响 A.对照；B.RR；C.NaHS；D.NaHS+RR；E.盐碱胁迫；F.盐碱胁迫+RR；G.盐碱胁迫+NaHS；H.盐碱胁迫+NaHS+RRFig.5 Effect of RR on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.RR; C.NaHS; D.NaHS+RR; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+RR; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+RR

2.4 LaCl3对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响

由图4可知，与对照(A)相比，LaCl3处理(B)显著降低了D值。LaCl3与盐碱胁迫共处理(F)的D值显著低于单独盐碱胁迫处理(E)。LaCl3显著消减NaHS对盐碱胁迫下D值的提升作用(H与G相比)。LaCl3阻断胞外Ca2+的内流。说明限制胞外Ca2+向胞内的流动将抑制H2S对盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的促进作用。

2.5 钌红对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响

由图5可知，与对照(A)相比，钌红RR处理(B)使D值显著下降，NaHS处理下增添RR也使D值显著降低(D与C相比)。盐碱胁迫下增添RR导致D值有所下降(F与E相比)，且NaHS提高盐碱胁迫下D值(G与E相比)的作用，在添加RR后被完全逆转(H与G相比)。RR抑制液泡Ca2+向胞质的释放。表明阻断液泡Ca2+向胞质的转移将降低H2S对盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的促进作用。

2.6 Thaps对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响

毒胡萝卜素Thaps处理(B)与对照(A)相比，D值显著下降。NaHS处理下添加Thaps也使D值显著降低(D与C相比)。但盐碱胁迫下添加Thaps处理(F)的D值与单独盐碱胁迫处理(E)的D值差异不显著；NaHS提高盐碱胁迫下D值(G与E比较)的作用在增添Thaps后也无显著影响(H与G相比)(图6)。Thaps是内质网钙泵阻断剂，单向抑制胞质Ca2+向内质网的转运，从而诱导胞质Ca2+浓度的提高。表明阻断胞质Ca2+向内质网的转运对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响不大。

图6 Thaps对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的影响 A.对照；B.Thaps；C.NaHS；D.NaHS+Thaps；E.盐碱胁迫；F.盐碱胁迫+Thaps；G.盐碱胁迫+NaHS；H.盐碱胁迫+NaHS+ThapsFig.6 Effect of thapsigargin(Thaps) on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.Thaps; C.NaHS; D.NaHS+Thaps; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+Thaps; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+Thaps

3 讨论

种子萌发是植物完成生活周期的关键，也是对盐碱胁迫最敏感的时期。已有的研究多以单一或少数萌发指标来反映盐碱胁迫的影响[1,16]。本研究模拟甘肃盐碱地盐分组成，以发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长七项发芽指标，采用隶属函数综合评价盐碱胁迫对裸燕麦种子萌发的影响。结果表明，裸燕麦种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长随盐碱胁迫强度提高明显下降(表1)，隶属函数综合评价值D显著降低(图1)，其中30 mmol·L-1盐碱胁迫的种子发芽率下降至对照的54.4%，D值降至对照的26.9%，表明盐碱混合胁迫显著抑制裸燕麦种子的萌发。这与前人以单一盐胁迫抑制燕麦种子萌发的研究结果类似[1]，但盐碱混合胁迫对种子萌发的抑制程度更大。

H2S作为植物内源新型气体信号分子，参与植物种子萌发过程的调控[3]。外源H2S供体NaHS处理可缓解干旱胁迫对小麦[6]和水稻[7～8]种子萌发的抑制。10～130 μmol·L-1NaHS浸种能不同程度缓解100 mmol·L-1NaCl胁迫下小麦种子萌发指数和幼苗生长量的下降，其中以50 μmol·L-1NaHS的作用效果最好[20]。本试验表明，100～1 000 μmol·L-1NaHS能不同程度增强裸燕麦种子萌发的隶属函数综合评价值D(图2A)，30 mmol·L-1盐碱胁迫下外施100～800 μmol·L-1NaHS不同程度提高了裸燕麦种子萌发的D值(图2B)，其中100 μmol·L-1NaHS的效果最好。说明适宜浓度的H2S能够缓解盐碱胁迫对裸燕麦种子萌发的抑制。其原因一方面可能与外源H2S能够提高胁迫条件下萌发种子淀粉酶和酯酶活性、增强种子抗氧化能力有关[21]；另一方面可能是H2S能够抑制盐诱导的K+外流和增强Na+外排，维持K+/Na+平衡，从而减轻盐离子毒害所致[22]。有研究表明，H2S通过NO途径提高紫花苜蓿种子萌发过程中对盐胁迫的耐受性[10]；NO促进干旱胁迫下紫花苜蓿种子萌发的过程通过Ca2+信号传导通路[23]；盐胁迫下NO促进玉米种子萌发的过程有Ca2+参与[16]；Ca2+也参与H2O2对盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的促进[17]。而H2S调控植物种子萌发对逆境响应的过程通常与NO、H2O2及Ca2+等信号存在“交叉对话”[18]；H2S和植物激素脱落酸(ABA)在调节植物根生长和气孔运动中也相互影响[24]。那么，胞质Ca2+浓度改变对H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的作用有无影响，本研究利用药理学实验发现，在100 μmol·L-1NaHS显著促进30 mmol·L-1盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的过程中，当分别添加EGTA(胞外Ca2+螯合剂)、氯化镧(细胞膜Ca2+通道阻断剂)和钌红(液泡Ca2+释放抑制剂)后均显著逆转了NaHS的作用(图3～5)，而添加毒胡萝卜素(内质网钙泵阻断剂)对NaHS的作用无显著影响(图6)。说明胞质Ca2+参与H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的信号传导过程，且胞质Ca2+主要来源于胞外Ca2+的内流和液泡中Ca2+的释放。

Knight[25]指出，盐胁迫引发的细胞质Ca2+增加除来自胞外Ca2+内流外还有三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,IP3)介导的液泡Ca2+的释放。李洪旺等[19]研究表明，H2S通过促进胞外Ca2+内流和胞内钙库Ca2+释放提高了保卫细胞胞质Ca2+浓度，从而促进H2O2产生，诱导拟南芥气孔关闭。H2S增强拟南芥根系耐盐性需要H2O2的参与[26]。液泡膜上Ca2+通道有2种：一种是受IP3调节的Ca2+通道；另一种是受电压门控的Ca2+通道[27]。在谷子响应铬离子(Cr6+)胁迫的过程中，胞内H2S的产生受Ca2+调控，并以H2S依赖方式增强重金属螯合剂编码基因的表达，外施H2S促进Ca2+感知基因的表达[14,28]。而H2S缓解盐碱胁迫对植物种子萌发抑制的过程中是如何调控质膜Ca2+内流以及通过什么方式调节液泡膜Ca2+释放通道，外施H2S是否也通过提高内源H2S含量增强Ca2+感知基因表达以及这些过程中是否有H2O2等信号的介导等问题尚需进一步探究。

综上所述，外源H2S能够促进盐碱胁迫下裸燕麦种子的萌发；限制胞外Ca2+内流和液泡Ca2+向胞质释放将消减H2S对盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的促进作用。表明胞质Ca2+参与外源H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发过程的调控。