陈佳琪,杜晓倩,范雪毅,周琛凯,饶桂维,王 磊
( 1.杭州师范大学 钱江学院,浙江 杭州 310018;2.浙江树人大学 生物与环境工程学院,浙江 杭州 310015 )
槲皮素(Quercetin,Qe),化学命名为 3,5,7,3',4'-五羟基黄酮,属于黄铜醇类化合物[1]。具有心血管保护[2-3]、抗氧化[4-6]、抗肿瘤[7-10]和抗血小板聚集[11-12]等生物活性。目前,对于槲皮素的应用越来越多,对其的衍生物合成方面也有很多的研究。但大多都是用聚乙二醇将槲皮素进行包埋。我们的研究拟对槲皮素进行结构修饰,与聚乙二醇(PEG-2、PEG-4、PEG-6、PEG-1000、PEG-10000)进行合成,运用化学的方法将聚乙二醇连接到槲皮素的其中一个羟基上,可得到水溶性更高、分子量更大、生物利用度高、生物活性好的产物,其在体内的停留的时间更久,发挥药效时间更长。
仪器:高效液相分析HPLC(岛津LC-20A)、高速逆流色谱HSCCC(TBE300C)、 旋转蒸发器(RE 52-99A上海亚荣生化仪器厂)、红外光谱仪(德国BRUKER公司)、TJ270-300红外分光光度计、UV-2600紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)。
试剂:槲皮素,无水碳酸钠,PEG-2(PEG-4、PEG-6、PEG-1000、PEG-10000),DMF,氯仿(分析纯),甲醇(分析纯),浓硫酸(分析纯),薄层层析硅胶(化学纯),正己烷,乙酸乙酯,无水乙醇,色谱甲醇,氯乙酸酐。
式1中PEG也或与其它位置的羟基进行反应
The PEG in Formula 1 may also be reacted with a hydroxyl group in other locations
用电子天平取0.10g槲皮素于干燥无水带有磁子的三颈烧瓶中,加入8.0mL DMF和0.0967g无水碳酸钠,三颈烧瓶先抽真空再充满氮气,本次反应在氮气保护环境下进行,在磁力搅拌的情况下反应1h后加入3.0mL PEG-4,同样在氮气保护环境下反应4h后得到槲皮素衍生物,反应期间每2h取1.0mL定容到100mL用高效液相色谱仪进行检测是否反应得到槲皮素衍生物。如图2-1(PEG-4反应1h)和2-2(PEG-4反应4h)。
图1 PEG反应1h
图2 PEG反应4h
选择使用正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、蒸馏水进行溶剂体系的配比,见表1。
表1 实验选择的溶剂体系
本次高速逆流色谱所需的溶剂体系在经过多次高效液相色谱法的检测后,最后决定使用正己烷:乙酸∶乙酯∶无水乙醇∶水=0.8∶1∶1∶1.2,此时上相:下相=1.3335。上下相峰面积分别如图图3、图4。
图3 上相液相色谱图
图4 下相液相色谱图
将带有无水碳酸钠、DMF的槲皮素衍生物通过砂芯漏斗过滤除去衍生物中少量无水碳酸钠,再通过旋转蒸发仪进行蒸发有机溶剂DMF,最后用真空耙式干燥机对旋蒸后的产物进行烘干得到粉末状槲皮素衍生物。最后在经过高速逆流色谱仪进行分离提纯得到较为纯净的槲皮素衍生物,得到图5。
图5 槲皮素衍生物高速逆流色谱图
抗氧化性检测采用的是DPPH法,其溶液在 517 nm 处有最大吸收值,且与浓度呈线性关系。抗氧化剂能够结合或替代 DPPH,使溶液吸光度变小,以1mL样品与3mL无水乙醇混合后溶液作为空白对照,测得吸光度Ao。以1mL无水乙醇代替槲皮素衍生物溶液,测得吸光度 As。通过检测 517 nm 的吸光度值计算物质的抗氧化能力,测得517nm处的吸光度Ay。并按如下公式计算 DPPH 自由基清除率:
Ay:1mL 样品溶液与 3mL DPPH 溶液混匀后的吸光度值;As:1mL 无水乙醇与 3mL DPPH 溶液混匀后的吸光度值;Ao:1mL 样品溶液与 3mL 无水乙醇混匀后的吸光度值。
表2 槲皮素衍生物产量随时间变化
表2(续)
根据表格2实验数据得到槲皮素与PEG-4的槲皮素衍生物的产量较多。
实验将槲皮素分别与PEG-2、PEG-4、PEG-6、PEG-1000以及PEG-10000反应,经高效液相色谱仪检测峰面积后发现槲皮素与PEG-4得到槲皮素衍生物的峰面积得到的产量较多,且在4h时得到的产物更多,4h之后会发生副反应,使产物减少。同时,分离产物需要在2h内,否则产物氧化,槲皮素衍生物的峰面积下降,杂质含量大大增加。