酶法水解脱脂乳及其对嗜热链球菌增殖效果研究

杜永新，段玉霞，马万平，赵世伟，杨子彪

（云南皇氏来思尔乳业有限公司，云南大理 671003）

0 引言

脱脂乳（Skimmed milk powder，SMP） 是鲜乳通过物理方法将脂肪经高速离心机脱去，再经过浓缩、喷雾干燥而制成，其脂肪含量较低（≤2.0%），蛋白质含量高（≥32%）；按照加工方式可分为低热脱脂乳、中热脱脂乳、高热脱脂乳等[1]。脱脂奶粉主要用作加工其他食品的原料，或是特殊营养需要的消费者食用[2]，其含有优质的氮源、碳源、维生素及微量元素等[3]，适合乳酸菌生长，但其凝乳性导致菌体不易被收集，很少用于工业发酵剂的制备。随着蛋白酶制备技术的成熟，脱脂乳酶解液开始用于乳酸菌的培养，以脱脂乳酶解液作为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌基础培养基，其活菌数比脱脂乳高，且利用此培养基得到的冻干发酵剂质量也较好[4]。蛋白酶解物不仅能促进乳酸菌的增殖[5]，还能提高乳酸菌长期保存时的生存能力[6]，且添加在发酵制品中能够增强产品的稳定性和风味；脱脂乳酶解液培养出的乳酸菌具有安全性高、活菌数高、菌体易收集、抑菌性能强[7]等优点，故成为研究的热点。

通过研究影响脱脂乳乳蛋白酶解的工艺因素（包括酶解时间、加酶量、反应温度、起始pH 值），以促进乳酸菌增殖为出发点探究酶解脱脂乳对嗜热链球菌2017- a 的作用，进一步扩大脱脂乳粉的利用，以期为乳酸菌发酵剂的制备提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及材料

脱脂乳粉、WPC80，产自新西兰；嗜热链球菌，自分离菌株，云南皇氏来思尔乳业有限公司提供；中性蛋白酶（食品级，50 000 U/g）、L-Cysteine HCl，北京索莱宝科技有限公司提供；氢氧化钠（国产分析纯），天津市大茂化学试剂厂提供；酵母粉，安琪酵母股份有限公司提供；牛肉膏、鱼蛋白胨、胰蛋白胨，北京陆桥技术股份有限公司提供；蔗糖（国产分析纯），江苏强盛功能化学股份有限公司提供；葡萄糖、乳糖、MgSO4·7H2O、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为国产分析纯，天津市大茂化学试剂厂提供。

1.2 培养基

M17，参考张晓蕾[8]的方法配制。

改良M17 培养基（1 000 mL 用量）：牛肉膏15 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，乳糖5 g，鱼蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，MgSO4·7H2O 250 mg，蔗糖5 g，L-Cysteine HCl＊110 mg，WPC 80＊20.5%，黄瓜汁＊310%，磷酸氢二钠0.02 mol/L，磷酸二氢钠0.02 mol/L（备注：*1，*2 采用0.22 μm 无菌滤器过滤；*3 黄瓜汁的制备：选购新鲜的黄瓜，清洗、切片、称重，然后加水打浆，纱布过滤，于115 ℃下灭菌15 min，冷却后备用。）

按上述要求准确称取各组分，用去离子水定量到1 000 mL，于121 ℃下灭菌15 min；M17 琼脂糖培养基配制：在M17 液体培养基组分基础上加入技术琼脂粉12 g，于121 ℃下灭菌15 min。

1.3 试验设备

恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；分析天平，上海越平科学仪器有限公司产品；冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；SW-CJ-2FD 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；pH 计，METTLER TOLEDO 公司产品；CX41 型显微镜，日本奥林巴斯公司产品；立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化和培养

冻干菌种在M17 中于38 ℃下活化2 代，待形态恢复正常后，于4 ℃下保藏，备用。

以2%（V/V） 的接种量将活化后的菌株转接至不同水解脱脂乳培养液中，于38 ℃下恒温发酵24 h，发酵过程及发酵结束后测定相关指标。

1.4.2 脱脂乳水解液的制备

（1） 称量。准确称取脱脂乳粉12 g。

（2） 加热。100 mL ddH2O 加热至55～60 ℃。

（3） 溶解。将称量好的脱脂乳粉溶于ddH2O。

（4） 定量。测定上述溶液蛋白含量，控制在3.5%～3.7%。

（5） 调pH 值。将上述定量后溶解pH 值调至7.0。

（6） 称量。称取中性蛋白酶，加酶量为120 U/mL。

（7） 溶解。将中性蛋白酶加入上述溶液中，充分溶解混匀。

（8） 酶解。55 ℃下酶解，酶解过程中用0.5 mol/L NaOH 中和酶解液。

（9） 灭菌（酶）。温度115 ℃，时间10 min，灭菌结束快速冷却。

（10） 调pH 值。将体系pH 值调至7.0。

（11） 保存。室温或冷藏条件下保存备用。水解度计算公式：

式中：B——NaOH 体积，mL；

Mb——NaOH 浓度，mol/L；

α——氨基酸平均解离度，酪蛋白的1/α 为2.26；

Mp——蛋白质质量，g；

Htot——对于酪蛋白，取值为8.2 mmol/g[9]。

1.4.3 活菌数测定

活菌数测定参照GB 4789.35—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》 的方法进行[10]。

1.4.4 试验设计

影响脱脂乳水解反应的主要因素有酶解温度、起始pH 值、加酶量和酶解时间。首先进行单因素试验，在单因素试验结果基础上，以正交试验设计优化中性蛋白酶对脱脂乳的酶解条件。以加酶量（A）、起始pH 值（B）、酶解温度（C） 和酶解时间（D）进行正交试验设计。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.4.5 不同培养基对嗜热链球菌促生长对照试验

冻干菌活化2 代，按2%接菌量分别接种于脱脂乳酶解液培养基、M17 培养基和M17 改良培养基中，于38 ℃下恒温发酵24 h，发酵结束参照GB 4789.35—2016 法测定活菌数。

1.4.6 数据处理

采用Graphpad prism7 软件对数据进行统计分析，每组试验均重复3 次，并做3 个平行样。

2 结果与分析

2.1 酶解温度对水解度的影响

酶催化底物反应的速度和酶的稳定性均受到酶解温度的影响。通常情况下，由于反应底物的不同，中性蛋白酶对其最适酶解温度也有所不同。参照说明书，中性蛋白酶的最佳酶解温度为30～60 ℃，其最佳酶解pH 值5.5～7.5。为探究酶解温度对中性蛋白酶酶解乳蛋白的影响，设定起始pH 值7.0，加酶量120 U/mL，酶解时间3.0 h，最终以水解度作为指标，探究不同酶解温度对脱脂乳乳蛋白水解度的影响规律。

酶解温度对水解度的影响见图1。

由图1 可知，水解度随着酶解温度的升高而升高。在40～50 ℃内水解度较在50～60 ℃反应温度内上升慢，造成此现象主要原因是：在适宜的反应温度下，随着反应温度的升高，加聚了反应物分子间的接触，使得反应更为剧烈；在50～60 ℃内，中性蛋白酶酶活性较强，在同等条件下其反应速度就较其他反应温度下降快。结果表明，中性蛋白酶酶解脱脂乳乳蛋白其反应温度在60 ℃时效果最好，由于脱脂乳粉中含有还原糖，经酶解后的产物中含有大量氨基化合物，在适宜条件下会发生美德拉反应，使酶解物颜色加深，并且在一定范围内温度对美德拉反应有正促进作用。为避免美拉德反应对酶解物的影响，所以选定55 ℃最为酶解温度。

2.2 起始pH 值对水解度的影响

由上述结果可知，中性蛋白酶在55 ℃时综合效果较佳；在加酶量120 U/mL，酶解时间3.0 h，酶解温度55 ℃条件下，探究不同起始pH 值对水解度的影响。

起始pH 值对水解度的影响见图2。

由图2 可知，中性蛋白酶的pH 值为6.0 时水解度较低；起始pH 值在6.0～7.5 内，水解度随起始pH值的增加而加快；当起始pH 值超过7.5 时，水解度开始下降，并且水解液的颜色也随之加深。由于在测定水解度过程中添加NaOH，反应过程会产生的盐，会使溶液渗透压增大，不利于菌体生长，综合考虑选定起始pH 值7.5 作为最佳起始pH 值。

2.3 酶解时间对水解度的影响

由上述试验确定的结果，设定酶解温度55 ℃，起始pH 值7.5，在加酶量120 U/mL 下探究不同酶解时间对脱脂乳乳蛋白酶解度的影响。

酶解时间对水解度的影响见图3。

由图3 可知，在上述优化酶解条件下，随着时间的增加，水解度呈现先增大后减小的趋势。在酶解时间开始2 h 内，水解度增加趋势较2～3 h 内较慢；水解3 h 后水解度呈现下降的趋势；在酶解反应开始2 h 内底物浓度较高，在其最适宜反应温度和起始pH 值条件下，酶与底物浓度比高，酶活力高，反应较快；随着酶解时间的增加，在2～3 h 时，酶与底物浓度虽然下降，但酶活力达到最高，酶解效率最佳；在3 h 后酶与底物浓度比降低，反应也随之降低。为在短时间内达到最佳酶解效果，最终选定3 h作为酶解时间。

2.4 中性蛋白酶添加量对水解度的影响

由上述试验确定的结果，设定酶解温度55 ℃，起始pH 值7.5，酶解时间3 h，在加酶量分别为60，120，180，240，300 U/mL 下探究不同加酶量对水解度的影响。

加酶量对水解度的影响见图4。

在整个酶解过程中由于底物蛋白的量是充足的，酶的添加量决定了酶与底物浓度比，故酶的添加量可以准确地反映酶的反应速率。由图4 可知，加酶量为120～180 U/mL 时，酶的反应速率增加较快；添加酶量超过180 U/mL 后，酶解度速缓慢。综合考虑水解度和生产成本，选定加酶量为180 U/mL。

2.5 脱脂乳乳蛋白酶解条件优化

试验确定了最佳单因素影响条件，在上述试验结果基础上对加酶量、起始pH 值、酶解温度和水解时间进行L9（34）正交试验，以确定中性蛋白酶酶解脱脂乳乳蛋白的最佳工艺参数组合。

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

对上述结果进行分析可知，影响脱脂乳乳蛋白水解度的因素主次关系依次为加酶量＞起始pH 值＞酶解温度＞酶解时间。在整个酶解过程中，底物蛋白是绝对够量的，也就是说乳蛋白的酶解程度主要取决于酶的添加量，其次是起始pH 值，最后是酶解温度和酶解时间。由试验结果和正交分析可知，乳蛋白最佳酶解条件组合为A3B1C2D1，所以最终选定酶解脱脂乳乳蛋白工艺为中性蛋白酶添加量180 U/mL，酶解温度55 ℃，起始pH 值6.5，酶解时间2 h。

2.6 不同水解度脱脂乳对嗜热链球菌2017-a 的促生长作用情况

经酶解后的脱脂乳富含大量的生物活性物质，可促进益生菌的生长。为探究酶解脱脂乳对嗜热链球菌2017-a 的促生长作用，以便于生产应用，分别将脱脂乳在优化酶解条件下分别酶解时间0.5，1.0，1.5，2.0 h，水解结束经灭菌（酶） 处理作为培养基，同时以不同培养基为参照，以活菌数作为指标，验证脱脂乳水解物对嗜热链球菌2017-a 的促生长作用，试验结果如下。

不同水解度脱脂乳对2017-a 促生长作用情况见图5，不同培养基对嗜热链球菌2017-a 促生长作用情况见图6。

上述结果表明，脱脂乳经中性蛋白酶酶解后其酶解物对嗜热链球菌2017-a 的生长有促进作用，水解度不同促生长作用情况不同，在最优酶解条件下获得的酶解物促生长作用效果最佳，嗜热链球菌2017-a的菌落总数可达2.30×109CFU/mL，较市售M17 培养基其活菌数提高一个数量级（1.7×108CFU/mL）；结果表明，脱脂乳中性蛋白酶酶解物对嗜热链球菌2017-a 有明显的促生长作用。脱脂乳中含有丰富的乳清蛋白和酪蛋白，乳清蛋白酶解物可以增加溶解性，对成泡、凝集、乳化能力的改变有促进作用，获得的酶解乳清蛋白多肽具有抗高血压、降低婴儿配方奶粉过敏性等功能和生物特性[11]；其酪蛋白酶解物则具有促进凝结、抗过敏、抗血栓形成、促进矿物质吸收、调节胃肠吸收、抑制病原菌等多种功能，乳酸菌分解蛋白能力较弱，将富含氨基酸、寡肽的乳蛋白酶解物应用于菌体培养是能够实现乳酸菌快速增殖和发酵[12-14]。

2.7 脱脂乳酶解物发酵剂稳定性

为验证脱脂乳水解物稳定性，将制备的酶解物经灭菌（酶） 处理后，分别置于室温和冷藏条件下，测定其pH 值、无菌检测等相关性能；并将菌株转接至水解物中，制得发酵剂，并测定发酵剂相关性能，试验结果如下。

酶解脱脂乳培养基在不同贮藏条件下pH 值变化见图7，酶解脱脂乳发酵剂pH 值变化情况见图8，酶解脱脂乳发酵剂在4 ℃冷藏条件下活菌数变化情况见图9。

上述试验结果表明，制备的脱脂乳酶解物在室温和冷藏条件下较为稳定，在保藏期间其组织状态未发生改变，无菌检测结果显示，在保藏期间无菌落生长；用酶解物制备发酵剂，其稳定性良好，在冷藏前期菌体继续生长，其活菌数最高可达2.84×109CFU/mL；酶解脱脂乳发酵剂性能测定结果显示可以将其作为理想的备用生产发酵剂。

3 结论

中性蛋白酶酶解脱脂乳的最佳工艺条件为加酶量180 U/mL，酶解温度55 ℃，起始pH 值6.5，酶解时间2 h，在此条件下脱脂乳乳蛋白水解度可达22.1%。在最优酶解条件下获得的脱脂乳酶解物促生长效果最好，嗜热链球菌2017-a 的菌落总数可达2.30×109CFU/mL，较商业M17 培养基其活菌数提高一个数量级，制得的脱脂乳酶解物稳定性良好，为生产发酵剂的制备提供了理论基础。