沃柑SSR分子标记筛选及其在品种鉴定上的应用

黄其椿， 卢东长城， 陈东奎， 江 东， 刘吉敏， 谢 健， 施平丽， 张 兰， 刘福平

(1.广西农业科学院园艺研究所，南宁 530007； 2.南宁维尔凯生物科技有限公司，南宁 530022；3.中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712； 4.广西农业科学院植物保护研究所，南宁 530007)

柑橘是全球种植面积最大和总产量最高的水果之一。中国是柑橘的起源中心之一，柑橘种质资源丰富。杂交选育是柑橘育种的重要策略，也造成了柑橘品种的高度遗传杂合性。近20年来，柑橘新品种主要来源于芽变选育[1-2]。芽变选育得到的新品种大部分性状来自原品种。近年通过引种和育种，使中国柑橘品种更加多样化。在鉴别柑橘品种上，虽然可通过枝叶形态等鉴定柑橘品种，但是形态学标记较少，特别在苗期时，由于营养、日照等环境因素影响叶片没有完全展开，有时难以进行品种鉴定。沃柑(Orah)是坦普尔柑橙与丹西红橘杂交的晚熟柑橘品种[3]，由于经济效益显著，近年来在广西、重庆、四川、云南等地快速推广，种植面积超过15.0万hm2[4]。随着种植面积的快速增加，如何确保沃柑品种的纯正，保证种苗的质量，加强种苗的检测工作变得更为重要。随着分子生物学的发展，SSR(simple sequence repeat)分子标记鉴定因快速准确，不受时间、环境条件影响等优点逐渐发挥重要作用，能够满足沃柑育苗的要求。DNA分子标记技术广泛应用于植物遗传多样性和种质鉴定中，其中常用的技术包括SSR、AFLP、RAPD、SNP等已应用于柑橘品种鉴定[5-8]。SSR分子标记的发展历史长，应用简易方便，为共显性分子标记，具有多态性丰富和PCR扩增结果重现性高的优点，被认为是研究群体遗传变异最好的标记之一[9]。刘通等利用SSR和SRAP分子对34份广西野生柑橘种质和地方品种进行遗传多样性分析[10]。李益等用503份种质经过多轮筛选出21个SSR标记[11]。曾涛利用SSR 分子标记构建了南丰蜜橘的指纹图谱并分析了各南丰蜜橘的遗传多样性[12]。刘召亮等应用SSR分子标记对江西各金沙柚主栽区的金沙柚及相关近缘种质进行分析，为金沙柚品种的鉴定、保存和评价等提供参考[13]。目前，国内沃柑SSR分子标记研究未见报道，生产上应用较少。本研究通过筛选SSR分子标记，可在不同时期、不同地块的多种柑橘品种中准确鉴定出沃柑，准确率100%，为SSR分子标记应用于沃柑的品种鉴定打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

第一批柑橘标样(Ⅰ)于2018年9月27日在广西农业科学院本部采集(记录好编号和品种)。第二批柑橘样品(Ⅱ)于2019年1月25日在广西农业科学院本部采集(第二、三、四批采集的样品由采集人记录好编号和品种。不告知检测人员品种信息)。第三批柑橘样品(Ⅲ)于2019年2月23日在广西农业科学院里建科研基地的柑橘采穗圃采集。第四批柑橘样品(Ⅳ)于2019年2月23日在广西农业科学院里建科研基地的柑橘观察圃和示范园采集。样品信息详见表1。成熟期剪取+1叶，4 ℃冰箱保存，采样后3 d内完成DNA提取。

1.2 DNA提取

每个样品取适量叶片，超纯水冲洗干净，晾干。剪取约0.1 g置于干净的2 mL EP管中，加入 800 μL CTAB后用组织研磨仪研磨。混匀，65 ℃水浴预热40～60 min，每隔10 min振荡混匀1次。12 000 r/min 离心5 min，吸取上清转入新的2 mL离心管中，按照1 ∶1加入氯仿剧烈振荡混匀，室温放置10 min。12 000 r/min离心10 min，吸取上清。加入1/10的3 mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。12 000 r/min离心10 min，沉淀用70%乙醇洗2遍，晾干。100～400 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存。

1.3 柑橘SSR检测

使用李益等报道的SSR引物[14]，这些SSR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列见表2。

表1 用于沃柑SSR分子标记检测的柑橘材料

表2 SSR引物编号及序列

PCR反应体系为：10×PCR buffer 2 μL；Mg2+(25 mmol/L) 2 μL；dNTP(10 mmol/L) 0.4 μL；引物F(0.5 μmol/L/μL) 1 μL；引物R(0.5 μmol/μL) 1 μL；TaqDNA Polymerase (5 U) 0.2 μL；模板 gDNA(25 ng/μL) 2 μL；用ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为： 94 ℃ 预变性5 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 延伸 10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

使用标品检测3对SSR引物的多态性时，每对引物均要检测到5条以上条带。在1%琼脂糖凝胶电泳图中，3对SSR引物扩增产物可清晰区分沃柑、少核茂谷柑、茂谷柑、华晚无籽沙糖橘、贡柑5个品种，但沃柑与无核沃柑SSR引物扩增产物之间未见显著差异(图1)。

2.2 多样本检验

为进一步检验这3个SSR分子标记在沃柑育苗、生产中的可靠性，在不同时期、不同地点取样，并增加更多的品种类型，进行SSR分子标记检测。结果发现，根据这3个SSR分子标记的检测结果(图2)，可在16个品种(沃柑、无核沃柑、少核茂谷柑、茂谷柑、华晚无籽沙糖橘、贡柑、爱媛38、晚血8号、濑户水、明日见、长叶香橙、清秋脐橙、纽荷尔脐橙、甘平、大雅1号、红肉脐橙)中准确、有效地检测到沃柑和无核沃柑，准确率达到了100%(表3)。

3 讨论

沃柑是坦普尔柑橙与丹西红橘杂交的晚熟柑橘品种。无核沃柑是由γ射线辐射诱变育成的沃柑新品种，在保留了沃柑生长势强、高糖、肉脆、多汁、味浓、越冬落果少、成熟后挂树期长等优点的同时，克服了普通沃柑多籽的缺点。由于经济效益显著，近年来在广西、重庆、四川、云南等地，沃柑和无核沃柑得到快速推广。沃柑和无核沃柑从苗期到挂果需要2～3年时间，期间需要大量人力和财力投入。如不能有效鉴定沃柑种苗，一旦种植到假苗将对果农造成巨大的经济损失。

表3 根据检测结果判断是否为沃柑

本研究使用的3个SSR分子标记可以准确有效地从16个不同的广西、重庆、四川种植的主要柑橘品种中筛选出沃柑和无核沃柑，但因沃柑和无核沃柑的SSR条带没有差异，因此无法区分沃柑和无核沃柑。无核沃柑是由γ射线辐射诱变育成的沃柑新品种，其遗传背景与沃柑非常相似，目前暂未见可有效区别这2个品种的分子标记的相关报道。目前沃柑和无核沃柑在广西的种植表现和经济收益都较高，因此即便本研究使用的SSR分子标记无法区分无核沃柑和沃柑，但有效地从多种柑橘品种中区分出无核沃柑和沃柑，在生产实践中仍然具有应用价值。

本研究中使用低分辨率的琼脂糖电泳仍可以有效地筛选出沃柑和无核沃柑。由于与毛细管电泳相比，琼脂糖电泳对实验室设备要求不高，而与聚丙烯胺电泳相比，琼脂糖电泳更快速便利，因此低分辨率的琼脂糖电泳可作为沃柑品种鉴定和杂交选育新品种中SSR分子标记筛选的有效而经济的实验技术。另一方面，随着基因组测序技术的发展，简化基因组测序成本大大降低，开发更新一代的SNP分子，有希望更准确高效地广泛筛选柑橘品种，包括有效区分近缘品种(如沃柑和无核沃柑)。