圈养大熊猫所食苹果和胡萝卜的气味特点与香气成分研究

鲜义坤，杨 楠，孔 凌，李裕冬，刘张育，陈绪玲，邓 虹，熊铁一*

（1.四川省自然资源科学研究院，成都 610041；2.成都大帝汉克生物科技有限公司，成都 611130）

在人工饲养条件下每天都要喂给亚成年和成年大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）一定数量的水果类食物——苹果和蔬菜类食物——胡萝卜[1-2]，以补充维生素等营养物质，保障大熊猫身体健康和快乐生活。野生大熊猫对竹子具有明显的选择性采食[3-4]，圈养大熊猫对不同种类的水果也呈现不同的采食选择倾向，对有些水果供试大熊猫都不采食，对有些水果有的个体采食而有的个体不采食[5]，但对苹果却普遍表现出非常喜欢采食，此外对胡萝卜也喜欢采食。除采食习惯外圈养大熊猫为什么喜食苹果和胡萝卜？这2种果蔬类食物对圈养大熊猫来说是否存在气味方面的诱食机制？本文试图揭开圈养大熊猫优先选择苹果和胡萝卜采食的气味之秘。

国内外对苹果气味物质的研究已有半个多世纪之久，通过多种不同的分析方法，共鉴定出300余种挥发性有机物（VOCs），不同的分析方法、品种、产地、栽培管理水平、采收时期、贮藏条件和时间等均有不同的成分测定结果，但与特征性香气有关的物质只有20～40 种[6-7]，这方面的文献较多[6-15]；而对胡萝卜气味物质研究的报道较少[16-22]；均从人的喜食风味偏好和市场购买意愿角度去研究以便加工改善或育种改良，但未从大熊猫喜食气味机理角度来分析这2种果蔬类食物的气味及其成分。盐源县隶属四川省凉山彝族自治州，地处青藏高原东南缘，享有亚热带季风气候，日照时间较长，所产苹果个小味甜，未检索出盐源苹果气味成分的专门研究报道。顶空（HS）—固相微萃取（SPME）—气相色谱（GC）—质谱（MS）联用分析技术可直接检测样品散发出的挥发性有机物，能真实、准确地反映样品的气味物质种类及其浓度，成为当今世界测定样品中未知气味成分的主流方法。本文通过专业人员的嗅感品评和HS-SPME-GC-MS 联用法研究苹果和胡萝卜的气味特点与香气成分，旨在探寻大熊猫喜欢的食物气味及其物质，进而探讨大熊猫喜欢选择这2种果蔬类食物采食的气味机理。

1 材料与方法

1.1 试验动物

供试大熊猫2 只，1 只为春俏（雌性），谱系号968，生于2015年8月8日，采样时年龄3岁；另1只为冰晶（雌性），谱系号943，生于2014年9月29日，采样时年龄4 岁；均属亚成体[1-2]，饲养于四川省峨眉山市仙芝竹尖生态园熊猫馆，健康状况良好，自由采食、饮水，圈内随意活动。按照规定的人工饲养规程进行日常饲喂和管理，每天喂给大熊猫600～800 g苹果和胡萝卜。

1.2 供试材料

①苹果：产于四川省盐源县，人工栽培，属富士品种，外观颜色几乎为暗红色，即富士红苹果（以下简称苹果），新鲜，果形较好，单果重为150～200 g。②胡萝卜：产地不详，人工种植，外观颜色为橙黄色，即橙色胡萝卜（以下简称胡萝卜），新鲜，外形好，单个重为300～400 g。苹果和胡萝卜均购自四川省峨眉山市城区农贸市场。

1.3 样品采集与制备方法

通过大熊猫的饲喂试验现场随机取样。苹果和胡萝卜先用流水清洗，去泥等异物，均未去皮，苹果也未去果核，可体现大熊猫闻嗅苹果和胡萝卜的真实气味。苹果、胡萝卜各任取1 个（根），一分为四，随机取出3块喂给大熊猫，当这3 块果蔬都分别被大熊猫全部吃完后另外1 块才用作样品，即所采样品可代表大熊猫所食的果蔬。如此获得的一些果蔬样品先切成细条状，再切成颗粒状，混合，随机取出用于VOCs 分析或气味品评的样品，制好的样品密封保存于-20 ℃的冰箱中待测评。采集的大样和备好的小样分别在装有冰袋的保温箱和保温桶中运输。在样品采集和制备之前所有与样品接触的用具用品须经反复清洗，达到干净无味，以防其他气味串入样品。

1.4 气味品评方法

供评样品称重2.0 g，与大熊猫所食其他食物一起编号，由6名专业品评人员在不知晓食物名称的情况下盲评。具体方法参见文献[23]。

1.5 HS-SPME-GC-MS方法

1.5.1 仪器设备

Agilent 7890B-5977B 型GC-MS 联用仪；HPINNOWax 型超高惰性石英毛细管色谱柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；20 mL顶空瓶及其相应的密封垫和铝盖；均由美国Agilent 公司出品。75 μm CAR/PDMS型SPME纤维头和SPME手动进样手柄均由美国Supelco 公司出品。其他器材和用品均为测试分析室常规配置。

1.5.2 HS-SPME方法

在70 ℃的条件下顶空萃取1 h。具体方法参见文献[23]。

1.5.3 GC-MS方法

GC 条件：进样口温度为250 ℃，载气为高纯氦气，柱流量为0.80 mL · min-1，进样模式为分流，分流比为5∶1。程序升温模式：起始温度45℃，保持3 min，以5 ℃·min-1速率升至180℃，再以8 ℃·min-1速率升至260·℃，保持10 min。MS 条件及其数据处理：同文献[24]的测试方法二。

1.6 香气成分的判定标准

经HS-SPME-GC-MS 联用法测定的大多数VOCs 均有不同类型和不同强度的气味，但有些气味物质对动物机体可产生不利甚至有害的影响。本文的香气成分仅限于我国、欧盟、美国、日本的法规允许在加工类食品中添加使用，且在市场上可流通交易的单体呈香物质，并非所有的挥发性有机物或气味成分。据此标准从已测定的VOCs 中选出食品级的香气物质，便于研制大熊猫专用诱食剂时参考与应用。

2 结果与分析

2.1 气味的嗅感品评

2.1.1 苹果气味的嗅感品评

整体上香气浓郁、宽厚、圆润、新鲜、透发，扩散性较强，愉悦度较高。属水果香型[25]中的红苹果气味，清香飘溢，甜气明显，略带酒香和木香韵调，有人闻出微弱的酸香气息。

2.1.2 胡萝卜气味的嗅感品评

整体上香气强度较弱，愉悦度尚可。属新鲜、成熟的胡萝卜气味，甜香和清香相对突出，稍有木香和壤香韵调，有人闻出微弱的油脂气息。

2.2 VOCs和香气成分

2.2.1 苹果的VOCs和香气成分

图1 圈养大熊猫所食苹果的VOCs总离子流色谱

表1 圈养大熊猫所食苹果的VOCs

续表

苹果的VOCs：见图1和表1。

从表1可知，苹果中可确定（匹配度≥80%，下同）的VOCs 有72 种，各自归属于有机化合物的类别见表2。

由表2 可知，苹果中的VOCs 有9 类化合物。无论成分数量还是相对含量，酯类、烯烃类及醇类均为排在前3 位的类别，这3 类VOCs 成分数累计达59 种，占VOCs 成分总数的81.94%，相对含量累计达92.35%，说明酯类、烯烃类及醇类是苹果的3 大主要有机化合物类别，其中最主要的VOCs是酯类，与文献[6-8,10-15]一致。

苹果的香气成分：详见表1 中带※号的成分。由表1和表2可知，苹果中可确定的香气成分有55种，占VOCs总数的76.39%，各自归属于有机化合物的类别见表2。由表2 可知，苹果中的香气成分有8类化合物。就成分数量而言，酯类、醇类及烯烃类是排在前3位的类别，累计达47种，占香气成分总数的85.45%；而在相对含量方面，则酯类、烯烃类及醇类是排在前3 位的类别，累计达89.94%，可见这3类香气成分是苹果气味的主要贡献物质种类，对苹果多种气味的形成可能起到主要或主导作用。相对含量排在前10 位的单一香气成分由高到低依次为α-金合欢烯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、乙酸顺式-2-己烯酯、丁酸己酯、乙酸丁酯、1-己醇、己酸丁酯、辛酸丁酯，这10 种香气成分归类为酯8种（相对含量小计47.33%）、烯烃1 种（相对含量为26.51%）、醇1 种（相对含量为2.94%），相对含量累计达76.78%，对苹果主要气味及其强度可能起到重大作用。

表2 苹果中VOCs和香气成分的归类与相对含量统计

2.2.2 胡萝卜的VOCs和香气成分

图2 圈养大熊猫所食胡萝卜的VOCs总离子流色谱

胡萝卜的VOCs：见图2 和表3。从表3 可知，胡萝卜可确定（匹配度≥80%）的VOCs 有47 种，各自归属于有机化合物的类别见表4。

表3 圈养大熊猫所食胡萝卜的VOCs

续表

表4 胡萝卜中VOCs的分类与相对含量统计

由表4 可知，胡萝卜中的VOCs 有9 类化合物。就成分数量而言，烯烃类、酯类及芳烃类和醇类（并列）是排在前3 位的类别，按3 类VOCs 数量累计，有38种，占VOCs成分总数的80.85%。若按相对含量排序，烯烃类、芳烃类及醇类是排在前3位的类别，累计达97.66%，说明烯烃类、芳烃类及醇类是胡萝卜的3大主要有机化合物类别，其中最主要的VOCs是烯烃类，其次是芳烃类。

胡萝卜的香气成分：详见表3 中带※号的成分。由表3 和表4 可知，胡萝卜中可确定的香气成分有26 种，占VOCs 总数的55.32%，各自归属于有机化合物的类别见表2。由表2 可知，胡萝卜中的香气成分有6类化合物。就成分数量而言，烯烃类、酯类及芳烃类和酮类（并列）是排在前3位的类别,按3类VOCs数量累计，为22种，占香气成分总数的84.62%；而在相对含量方面，则是烯烃类、芳烃类及醇类是排在前3 位的类别，累计达82.81%，可见烯烃类和芳烃类这2大类香气成分是胡萝卜气味的主要贡献物质种类，对胡萝卜多种气味的形成可起到主要或主导作用。相对含量排在前10 位的单一香气成分由高到低依次为β-石竹烯、对伞花烃、γ-松油烯、异松油烯、a-蒎烯、d-柠檬烯、β-月桂烯、乙醇、β-蒎烯、α-松油烯，这10 种香气成分归类为烯烃8 种（相对含量小计58.22%）、芳烃1 种（相对含量为20.25%）、醇1 种（相对含量为1.71%），相对含量累计达80.18%，对胡萝卜主要气味及其强度可能起到重大作用。

由上述可知，圈养大熊猫喜食果蔬类食物的气味物质类别较为宽泛，共有醇类、醛类、酮类、羧酸类、酯类、烯烃类、芳烃类、杂环类等8类，其中主要是酯类、烯烃类、醇类、芳烃类。

3 讨论

3.1 圈养大熊猫所食苹果和胡萝卜气味形成的物质基础

依据文献[26-27]对具有FEMA编号的单体呈香物质气味特征记载，如：己酸乙酯的气味特征为甜的、清香、水果、菠萝、苹果、脂肪、奶制品香气。从表1 和表3 中可分别找到可能引起苹果和胡萝卜多种气味的一些香气成分。

苹果的水果香气味可能与乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、己醛、乙酸-2-甲基丁酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、丙酸己酯、异丁酸己酯、1-己醇、乙酸庚酯、丙酸反式-2-己烯酯、反式-2-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、辛酸乙酯、异丁酸顺式-3-己烯酯、丁酸反式-2-己烯酯、2-甲基丁酸反式-2-己烯酯、己酸戊酯、己酸己酯、辛酸己酯（以表1 中出现的先后为序，下同）等26种香气成分有关。清香气味可能与2-甲基丁酸乙酯、己醛、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸叶醇酯、异丁酸己酯、1-己醇、乙酸庚酯、反式-2-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、1-庚醇、己酸戊酯、1-辛醇、己酸己酯、顺式-β-金合欢烯、α-金合欢烯、顺式、反式-α-金合欢烯、辛酸己酯等22 种香气成分有关。甜香气味可能与乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸-2-甲基丁酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、异丁酸己酯、1-己醇、辛酸乙酯、己酸戊酯、1-辛醇、己酸己酯、水杨酸甲酯等15 种香气成分有关。酒香气味可能与乙酸乙酯、乙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、辛酸乙酯、1-庚醇、己酸戊酯等8种香气成分有关。木香气味可能与己醛、乙酸庚酯、2-甲基丁酸己酯、β-石竹烯、顺式-β-金合欢烯、α-金合欢烯、顺式，反式-α-金合欢烯等7 种香气成分有关。酸香可能与丙酸己酯等香气成分有关。苹果的独特气味可能与戊酸乙酯、反式-2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸叶醇酯、异丁酸己酯、己酸丁酯、辛酸己酯等8种香气成分有关。

胡萝卜的水果香气味可能与β-月桂烯、γ-松油烯、β-罗勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丁酸己酯、己酸己酯、2-甲基丁酸、β-红没药烯、顺式-α-红没药烯、反式-γ-红没药烯、α-红没药烯、香叶基丙酮、异戊酸芳樟酯（以表2 中出现的先后为序，下同）等13种香气成分有关。清香气味可能与β-月桂烯、β-罗勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丁酸己酯、己酸己酯、β-红没药烯、顺式-α-红没药烯、反式-γ-红没药烯、α-红没药烯、香叶基丙酮等10 种香气成分有关。甜香气味可能与d-柠檬烯、β-罗勒烯、己酸己酯、水杨酸甲酯等4种香气成分有关。木香气味可能与a-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-罗勒烯、异松油烯、乙酸冰片酯、β-石竹烯、β-红没药烯、顺式-α-红没药烯、反式-γ-红没药烯、α-红没药烯、香叶基丙酮、氧化石竹烯等14 种香气成分有关。壤香可能与莰烯等香气成分有关。油脂气息可能与6-甲基-5-庚烯-2-酮等香气成分有关。胡萝卜特殊的气味可能与相对含量排名第二的对伞花烃等香气成分有关。

总之，苹果和胡萝卜的某种气味并非由一种香气成分引起，而是由多种香气成分相互作用（协同增效或抵消减弱）后的结果[28]。

3.2 圈养大熊猫喜欢的食物气味

通过对圈养大熊猫采食行为的仔细观察，圈养大熊猫喜食苹果和胡萝卜。结合上述气味成分剖析，作者认为圈养大熊猫喜欢食物的综合性气味有水果香气味、苹果气味、胡萝卜气味等，就单一香型气味而言有清香气味、甜香气味等，这些气味是诱导圈养大熊猫采食苹果和胡萝卜的主要气味，可能因为圈养大熊猫熟悉这些气味并认知它们是安全的，为自然选择和长期进化所致。在食物供给充足的人工饲养条件下，食物的气味是决定圈养大熊猫优先选择采食的首要食物因素，当然圈养大熊猫喜食苹果和胡萝卜还可能与采食习惯、苹果和胡萝卜的适口性（包括味道和质构等）以及营养性等有关，有待进一步研究。

4 结论

通过专业人员的嗅感品评，圈养大熊猫所食苹果的香气浓郁，扩散性较强，愉悦度较高，气味属水果香型中的红苹果气味，清香飘溢，甜气明显，略带酒香和木香；圈养大熊猫所食胡萝卜的香气强度较弱，愉悦度尚可，气味属新鲜、成熟的橙色胡萝卜气味，甜香和清香相对突出，稍有木香和壤香。经HS-SPME-GC-MS 联用法测定，从苹果中共测出55 种香气成分，可归类为醇8 种、醛3 种、酮1 种、羧酸2 种、酯35 种、烯烃4 种、芳烃1种、杂环化合物1种，相对含量较高的香气成分为α-金合欢烯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、乙酸顺式-2-己烯酯、丁酸己酯、乙酸丁酯、1-己醇、己酸丁酯、辛酸丁酯，可见酯类、烯烃类及醇类是苹果气味的主要贡献物质种类；从胡萝卜中共测出26种香气成分，可归类为醇1种、酮2 种、羧酸1 种、酯6 种、烯烃14 种、芳烃2种，相对含量较高的香气成分为β-石竹烯、对伞花烃、γ-松油烯、异松油烯、α-蒎烯、d-柠檬烯、β-月桂烯、乙醇、β-蒎烯、α-松油烯，可见烯烃类和芳烃类是胡萝卜气味的主要贡献物质种类。

致谢：西华大学食品与生物工程学院的包清彬教授、成都大帝汉克生物科技有限公司的李松柏高级工程师、黄明亚工程师、赵仁仟同志参加了香气品评以及喻麟董事长和李小兵总经理给予了支持,四川省峨眉山市仙芝竹尖生态园熊猫馆原馆长吴永中等同事在饲喂试验和采样时积极配合，中国科学院成都分院分析测试中心的胡静副研究员在挥发性成分分析与推定方面提供了帮助，在此一并深表谢意！