乌头属5种植物ITS2和psbA-trnH鉴别适用性研究

朱高倩 ， 李双良 ， 马莉 ， 周培军 ， 王丽 ， 符德欢

（1.云南省药物研究所，云南昆明 650111；2.云南白药集团创新研发中心，云南昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南昆明 650111）

乌头属植物为我国重要的药用植物资源，据《中华本草》记载可入药的有60余种，具有祛风、散寒、止痛、止痉等功效，可用于治疗风寒湿痹、关节疼痛、神经痛、四肢拘挛、半身不遂等病症，临床上广泛应用于镇痛、抗炎、局部麻醉、解热等[1]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版收载了乌头（A.carmichaelii）和北乌头（A.kusnezoffii）2个种，为川乌、附子、草乌、制草乌及草乌叶5个药材的基原植物[2]。

乌头属植物分布广泛，物种丰富，生品有大毒，民间多基于经验以其入药，缺乏规范性，存在较大的安全隐患，不利于以乌头类药材入药的中成药质量保证。乌头属植物的基原鉴定主要以其植物形态、花果特征为重要分类依据。乌头类的生药学研究常采用性状鉴别、理化鉴别、显微鉴别进行研究，如显微鉴别的淀粉粒数目、大小以及石细胞壁厚鉴别乌头属不同物种[3-6]，但这些鉴别存在依赖经验和主观性强的问题。近年来，随着DNA条形码技术的发展，《中国药典》2015年版[2]将“中药材DNA条形码指导原则”纳入中药材鉴别方法，其中ITS2和psbA-trnH作为植物类中药材DNA分子鉴定的重要鉴别位点。鉴于乌头类植物遗传分化复杂多样，目前乌头类的DNA条形码研究还处于探索研究阶段，已进行分子研究的乌头属植物种类比较有限，如郭豪杰等[7]对藏药材榜嘎及其混伪品的DNA条形码鉴定研究结果显示ITS系列可作为鉴定榜嘎[船盔乌头Aconitum naviculare（Bruhl.）Stapf或 甘 青 乌 头Aconitum tanguticum（Maxim.）Stapf的干燥全草]及其混淆品的有效条形码。张晓南等[8]对黄草乌、滇南草乌进行了ITS鉴别研究。He等[9]研究的19个种134个样品的乌头品种可以通过psbA-trnH基因间隔片进行鉴别。基于基原鉴定结果，本研究继续对乌头属5种植物的ITS2和psbA-trnH的鉴别适用性进行研究，以期补充完善乌头类药材DNA条形码信息数据，为加快乌头类药材DNA条形码应用提供基础数据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 药材 试验所用材料采自云南省丽江市宁蒗县、迪庆州香格里拉市、玉龙县等地，包括显柱乌头系的3个居群长喙乌头和1个居群石膏山乌头、蔓乌头系的3个居群瓜叶乌头和1个居群玉龙乌头、兴安乌头系的1个居群中甸乌头的新鲜叶片，并用硅胶干燥，其凭证标本由中科院华南植物园杨亲二研究员鉴定。5种乌头来源信息见表1。

表1 5种乌头的来源信息Table 1 Source information of 5 species of Aconitum

1.2 主要试剂 2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技术有限公司）；引物由华大基因合成；4S Green Plus无毒核酸染料（上海生工公司）；G-10琼脂糖（西班牙BIOWEST公司）；1×TAE缓冲液。

1.3 主要仪器 Mastercycler聚合酶链反应（PCR）扩增仪、Centrifuge 5418高速离心机（德国Eppendorf公司）；DYY-6C凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）；ZF-258全自动凝胶成像分析系统（上海金鹏分析仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 采用改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）[10]提取5种乌头叶片材料的DNA。

1.4.2 PCR扩增 采用引物ITS2F/ITS2R对提取DNA进行PCR扩增。引物序列同《中国药典》2015 年版[2]。ITS2F，5’-GCGATACTTGGTGTGAA T-3’；ITS2R，5’-GACGCTTCTCCAGACTACAA T-3’。psbA，5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’；trnH，5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’。反应体系为50 μL，其中含双链DNA模板2 μL，正反引物（浓度为10 pmol/L）各 0.2 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 22.6 μL。ITS2位点的PCR扩增条件：预变性94℃4 min；进入循环，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃终延伸7 min。psbA-trnH位点的PCR扩增条件：95℃预变性4 min；进入循环，94℃变性30 s，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终延伸10 min。取PCR产物5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在全自动凝胶成像分析系统下观察拍照。

1.4.3 PCR产物序列测定 PCR扩增产物直接送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

1.4.4 序列分析 用DNAMAN、Bioedit软件对PCR产物测序结果进行序列分析，基因区段通过NCBIBLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行确定。MEGA 5.1采用邻接法（NJ，Neighborjoining）[11]构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 乌头属5种植物的植物形态及块根特征 乌头属5种植物的植物形态及块根特征考察结果表明，5种乌头植物形态在茎形态方面有差异，干燥块根的形状、断面颜色、大小等方面不同。见图1、表2。其中，长喙乌头和石膏山乌头归属于显柱乌头系，直立茎，长喙乌头干燥块根呈棕色、多侧根、断面深褐色，石膏山乌头干燥块根呈深褐色、少侧根、断面褐色；瓜叶乌头和玉龙乌头归属于蔓乌头系，缠绕茎，干燥块根均呈深褐色，瓜叶乌头干燥块根呈圆锥形、断面灰褐色，玉龙乌头干燥块根呈倒圆锥形、断面褐色；中甸乌头归属于兴安乌头系，直立茎，干燥块根呈棕色、圆锥形、断面淡黄色。5种乌头的大小无明显界限。

2.2 乌头属5种植物ITS2和psbA-trnH的PCR扩增和测序情况 以ITS2F/ITS2R和psbA/trnH对乌头属5种植物共计70个样品进行扩增，结果见表3和图2。共67个样品成功扩增获得ITS2位点的PCR产物，全部测序成功；共69个样品成功扩增获得psbA-trnH位点的PCR产物，全部测序成功。

图1 乌头属5种植物的植株形态及干燥块根Figure 1 The features of the plant morphotypes and dried roots of 5 species of Aconitum

表2 乌头属5种植物的植物形态及干燥块根特征信息表Table 2 The characteristic data of plant morphotypes and dried roots of 5 species of Aconitum

表3 5种乌头ITS2和psbA-trnH的PCR扩增和测序情况Table 3 PCR amplification and sequencing results for ITS2 and psbA-trnH loci in 5 species of Aconitum （n/个）

2.3 乌头属5种植物ITS和psbA-trnH序列比对分析 5种乌头属植物9个居群67份样品的ITS2序列全长均为208 bp，5种乌头种间ITS2的序列比较。结果表明，3个差异位点可将显柱乌头系的长喙乌头和石膏山乌头、蔓乌头系的玉龙乌头鉴别开，但是蔓乌头系的瓜叶乌头和兴安乌头系的中甸乌头之间无差异位点。见表4。5种乌头中，ITS2的第169、185、203 bp处，长喙乌头为T、C、T碱基，玉龙乌头为C、A、T碱基，石膏山乌头为C、C、C碱基，瓜叶乌头和中甸乌头为C、C、T碱基。

图2 乌头属5种植物的ITS2和psbA-trnH位点的PCR扩增产物电泳图Figure 2 Electrophoretogram of PCR products of ITS2 and psbA-trnH loci in 5 species of Aconitum

5种乌头9个居群69份样品的psbA-trnH序列比对长度均为233 bp，虽有个别种内差异，但是种间无差异位点。见表5。第164个碱基处，瓜叶乌头有C/A碱基变异，其他4种乌头均为C碱基，在第217个碱基处，瓜叶乌头种内有缺失/T碱基的变异，其他4种乌头均为缺失。

2.4 系统发育分析 以5种乌头属植物的9个居群的ITS2位点的序列，通过邻接法建立系统进化树（如图3所示），结果显示该位点上显柱乌头系的长喙乌头和石膏山乌头分别位于明显的独立分支，而蔓乌头系的瓜叶乌头和玉龙乌头、兴安乌头系的中甸乌头位于一个大支，其中兴安乌头系的中甸乌头与蔓乌头系的瓜叶乌头最为近缘。

以5种乌头属植物的9个居群的psbA-trnH位点的序列通过邻接法建立系统进化树（如图4所示），结果显示瓜叶乌头的其中部分样品位于一独立分支，而其他乌头样品均位于一个大支内。

表4 5种乌头ITS2序列差异位点统计Table 4 Comparison of the specific loci of ITS2 sequence in 5 species of Aconitum

表5 7种乌头psbA-trnH序列差异位点统计Table 5 Comparison of the specific loci of psbA-trnH sequence in 5 species of Aconitum

3 讨论

3.1 乌头属植物传统分类与ITS2分子鉴定有机平衡 分子标记技术是研究或运用能反映生物个体间、种群间、物种间等分类单位的基因组中某种DNA片段差异的技术[12]。ITS序列是近年来用于探讨植物种间变异和种内变异以及近缘属间系统关系的重要分子标记，在植物分类中广泛应用[13-16]。前人研究也表明ITS序列在乌头属内部分物种也有一定的鉴别能力[17]。在本研究中ITS2对乌头属植物有一定的鉴别能力，可鉴别显柱乌头系的长喙乌头和石膏山乌头、蔓乌头系的玉龙乌头，但不能鉴别蔓乌头系的瓜叶乌头和兴安乌头系的中甸乌头，二者在ITS2位点构建的系统发育树上处于极为近缘的关系，表明蔓乌头系的瓜叶乌头和玉龙乌头之间的遗传距离大于蔓乌头系的瓜叶乌头与兴安乌头系中甸乌头之间的遗传距离，说明蔓乌头系与兴安乌头系可能存在分类交叉。此结果与肖培根等[18]基于二萜生物碱进行的乌头属化学分类不谋而合，即蔓乌头系可能是显柱乌头系和兴安乌头系的中间类群。而本研究中基于传统分类鉴定法的形态特征结果表明，蔓乌头系的瓜叶乌头为缠绕茎，兴安乌头系的中甸乌头为直立茎，具有明显的差异特征，与ITS2分子鉴定结果不同。因此，我们认为虽然ITS2对乌头属很多种有很好的鉴定能力，但是分子鉴定方法是基于传统分类鉴定结果建立的便捷方法，在其鉴定过程中应注意中间类群客观存在的同异问题，有机平衡传统分类和分子鉴定进行综合判定其类群位置。

3.2psbA-trnH对乌头属植物分子鉴别的局限性空psbA-trnH在《中国药典》2015年版中作为ITS2的辅助鉴定序列，在很多植物物种鉴定中确实具有很强的鉴定力以及保守性[19-20]。前人研究中该位点在乌头属的部分物种中也有一定的鉴定力，其中瓜叶乌头与其他乌头可很好地进行鉴别[9]，但是本研究中psbA-trnH对5个种的乌头鉴别均不理想，说明psbA-trnH对乌头属的鉴别具有一定的局限性，psbA-trnH序列不能鉴别显柱乌头系的长喙乌头和石膏山乌头、蔓乌头系的瓜叶乌头和玉龙乌头、兴安乌头系的中甸乌头等5种乌头属植物。原因可能是本研究中的5种乌头均产自云南丽江、迪庆等地，地理生态及其起源进化相对较近。

综上所述，ITS2、psbA-trnH单独使用或结合使用对乌头属的鉴别都有一定的局限性，应结合其他位点或其他技术领域进行综合判定。

图3 5种乌头属植物9个居群ITS2位点系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree for ITS2 loci in 9 population from 5 species of Aconitum

图4 5种乌头属植物9个居群psbA-trnH位点系统发育树Figure 4 Phylogenetic tree for psbA-trnH loci in 9 population from 5 species of Aconitum