MDR1甲基化对宫颈癌介入栓塞化疗疗效的影响

张悦 顾福嘉

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌。据统计，宫颈癌约占妇科恶性肿瘤的10%，年增加病例47.1万例，年死亡病例27.5万例[1-2]。手术和放疗是治疗宫颈癌的主要方法。然而，尽管近几十年来手术技术、放射治疗设备和技术不断更新，但治疗效果并未提高，5年生存率仅为70%。肿瘤局部失控和复发是治疗失败的主要原因，其次是淋巴转移。

新辅助化疗是指患者在主要治疗方法前接受一定疗程的化疗，以缩小肿瘤体积，提高手术效果，减少手术并发症，尤其适用于对放疗不敏感的腺癌患者[3]。宫颈癌对化疗具有中等敏感性，术前化疗可有效降低肿瘤负荷，控制癌旁组织浸润血管癌栓子，减轻放疗负担，提高手术成功率，降低复发率[4]。新辅助动脉内化疗是一种新的有代表性的治疗策略。本策略通过髂内动脉和子宫动脉栓塞化疗后行根治性器官切除和淋巴结切除。同时，该疗法可以保留子宫、输卵管和卵巢。因此，对于希望保留生育能力的早期宫颈癌患者具有重要意义。然而，很多患者对经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞并不敏感，因此对这类患者进行化疗会延迟整体治疗，产生不必要的副作用，增加患者的经济负担[5]。因此，迫切需要寻找预测化学敏感性的指标，为其治疗提供指导。

多重耐药（MDR）是导致肿瘤化疗失败的主要原因。相关研究表明，由MDR1基因编码的P-糖蛋白（P-gp）是MDR的标志物，抑制其表达可增强某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[6-7]。在这项研究中，使用免疫组织化学检测经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞前后宫颈癌组织中P-gp水平，并通过千碱基特异性裂解和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析MDR1基因的甲基化状态，探讨MDR1甲基化对宫颈癌术前介入化疗栓塞疗效的影响。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年1月至2018年1月在贵州省人民医院经病理证实接受介入化疗栓塞的宫颈癌患者67例，所有患者自愿接受超选择性子宫动脉血管腔内灌注化疗栓塞术，未选择外科手术及放射治疗，均已签署治疗知情同意书。另外，选取45例经宫颈活检或切除的正常宫颈组织作为对照。本研究经贵州省人民医院伦理委员会批准。该研究遵循《赫尔辛基宣言》的伦理准则。所有患者和正常个体均给予知情的书面同意并批准本研究。

二、实验方法

（一）免疫组化检测宫颈癌组织中P-gp水平

组织来源经阴道钳取宫颈组织，将宫颈癌组织介入治疗前后和正常宫颈组织嵌入石蜡，切成5 μm片，和传统的二甲苯脱蜡和梯度酒精水化。用3%过氧化氢溶液封闭组织，蒸馏水冲洗三次，柠檬酸缓冲液煮沸修复抗原。加入第一抗体（购自 Abcam PLC [Cambridge，UK]的小鼠抗 P-gp单克隆抗体）并置于4℃的加湿箱中过夜，用Tris缓冲盐水洗涤三次，二氨基联苯胺显色（ZSGB-BIO，DAB显色试剂盒，中国），苏木精染色1 min，脱水和透明，最后用中性香脂密封。已知的阳性活检被认为是阳性对照，磷酸盐缓冲盐水代替一抗被认为是对照。

（二）MDR1基因甲基化状态的检测

在介入治疗前后2～3周内，宫颈癌和正常宫颈组织用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen NV，Venlo，荷兰）进行DNA提取，严格按照规范进行。管家基因β-球蛋白引物序列正向：5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'； 反 向：5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'是PCR扩增的内部对照。通过测序确认PCR扩增产物，因为β-珠蛋白DNA的阳性宫颈样品（阳性对照）和灭菌的双蒸水（ddH2O）被设计为空白对照。通过2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。如果产物明显可见，则通过DNA质量检测。紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度。

（三）甲基化过程：PCR和体外转录

根据试剂盒说明，用亚硫酸氢盐处理DNA，然后用PCR进行检测。EZ DNA甲基化试剂盒购自Zymo 研究公司（Irvine，CA，USA）。反应体系为 3 μL，包括 0.9 μL ddH2O，0.5 μL10×PCR 缓冲液（Mg2+），0.4 μL MgCl2，0.1 μL 25 mMdNTP，1 μL 引物混合物和0.1 μL 5 U/μL PCR酶。引物的MDR1基因序列正向：5'-TTGGAGGTGAGATTAATTT-3'b；反向：5'-AAAAAAACCCCTACAATACCCATC-3'c，b和c是引物前缀，即每个正向引物标记10个碱基序列（5'-AGGAAGAGAG-3'），每个保留引物标记T7启动子（5'-CAGTAATACGACTCACTAT AGGGAGAAGGCT-3'）。反应条件为 94℃ 4 min，94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，总共 45 个循环，最后72℃ 3 min。反应后，取5 μL PCR产物，加入2 μL虾碱性磷酸酶混合物（包括0.3 μL虾碱性磷酸酶和1.7 μL ddH2O），离心并在37℃下孵育。20 min，然后在85℃下保持5 min以消除反应体系中的游离核苷酸。将产物（2 μL）置于微孔板中，加入5 μL转录/RNase A混合物（包括3.15 μL无RNase ddH2O，0.89 μL 5×Tris（T）和聚合酶缓冲液，0.24 μL T 裂解混合物，0.22 μL 将 100 mM DL-二硫苏糖醇（DTT），0.44 μL T7RNA和DNA聚合酶，和0.06 μL RNaseA）密封并离心。最后将产物在37℃下孵育3 h，并在4℃下保存。

（四）甲基化率的检测

通过千碱基特异性裂解法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，分析16个CpG岛的MDR1基因启动子区域的甲基化状态。采用纳米分配器将22 nL裂解反应液加入基质芯片中，采用质谱仪（Sequenom， San Diego，CA，USA）采集质谱。用Epityper 1.0软件分析质谱的甲基化率。

（五）评估标准

1.化疗疗效评价

在化疗前后2～3周经阴道超声检查三维径向线，根据单侧浸润参数计算肿瘤体积，主要表现为宫旁压迫、正常宫颈形态丧失、骶骨韧带消失。根据国际抗癌联盟的标准，疗效标准包括完全缓解、部分缓解、病情稳定、病情进展。完全缓解和部分缓解视为治疗有效，稳定疾病和病情进展视为治疗无效。

2. P-gp表达水平的评估

P-gp阳性颗粒在细胞膜和细胞质中呈褐色。在高倍镜下选择4个视野，计数200个细胞。阳性细胞计数，＜10%用“-”表示，10%～25%用“+”表示，25%～75%用“++”表示，＞75%用“+++”表示。+至+++为阳性表达。

（六）统计数据分析

使用SPSS 17.0软件进行数据分析。计数数据表示为百分比（%），组的比率通过χ2检验分析，相关性通过Spearman等级相关分析。通过Wilcoxon秩和检验分析宫颈癌组织治疗前后宫颈癌组织与正常宫颈组织之间的甲基化水平。P＜0.05被认为具有统计学意义。

结 果

一、患者的人口统计特征

患者年龄27～68岁，中位年龄53岁。根据国际妇产科联合会宫颈癌临床分期，将患者分为Ib2、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb分期，见表1。所有患者中，鳞癌48例，腺癌19例，也分为低分化、中分化和高分化程度（表 1）。

二、经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞前后正常组织和宫颈癌组织中P-gp的表达水平

正常宫颈组织中P-gp的阳性表达率为0%（0/45），经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞前后宫颈癌组织中P-gp的阳性表达率分别为61.19%（41/67）和77.61%（5/67）。介入化疗栓塞后P-gp阳性表达率高于经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞后（χ2= 4.2523，P=0.0392）。宫颈癌组织中化疗后P-gp的表达强度与化疗前相比有所增加（χ2=17.7301，P=0.0005） （见图1和表2）。

表1 本研究涉及的患者的人口统计学

三、P-gp表达对化疗前化疗疗效的影响

化疗前P-gp的阳性表达率与化疗效果呈负相关（r=-0.340，P=0.005）。P-gp的阳性表达率在有效化疗患者化疗前低于化疗无效的患者（χ2=7.7274，P=0.0054） （见表3）。

四、DNA的鉴定和纯化

用2%琼脂糖凝胶电泳进行β-球蛋白PCR产物后，靶片段出现在240 bp，如图2所示。紫外吸收度OD260/OD280为1.8～2.0，DNA浓度为0.5 ng/μL，适用于PCR扩增。

五、化疗前后正常组织和宫颈癌组织中MDR1的甲基化状态

图1 P-gp在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达

质谱准确定位基因片段各CpG岛的甲基化状态。本研究中每个样本扩增子包含16个CpG岛，每个CpG岛包含单个或多个CpG位点，如表4所列。正常宫颈组织中13个CpG岛（2、11、14、16）的甲基化率高于宫颈癌组织（P＜0.05）。化疗前6个CpG岛（4、5、8、10、16）在宫颈癌组织中的甲基化率高于化疗后，而14个CpG岛的甲基化率低于化疗后（P＜0.05） （见图3）。

六、MDR1甲基化状态对化疗敏感性的影响

有效化疗患者化疗前CpG_2，3和4位点甲基化率高于无效化疗患者，其他CpG位点甲基化率无差异（P＜0.05） （见图4）。

讨 论

MDR基因家族包括MDR1和MDR3，但只有MDR1基因可以产生MDR现象。MDR1基因位于7号染色体上的7q21.1-q21.3位点，包括29个外显子和28个内含子以及编码药物载体P-gp[8]。P-gp是ATP结合盒转运蛋白超家族的成员之一，具有能量依赖性扩增膜外排泵功能，从细胞中泵出多种抗肿瘤药物，使细胞内化疗药物达不到有效剂量，从而产生耐药物抵抗[9-11]。由P-gp介导的肿瘤的药物外排功能产生的MDR接近P-gp表达水平。P-gp在具有药物敏感性的肿瘤细胞中低表达，并在耐药肿瘤细胞中高表达[12]。Scheiner等[13]检测了109例急性髓性白血病患者的P-gp表达水平，结果显示P-gp的表达与治疗缓解率呈负相关，因此，它是预后不良的因素。ZHU等[14]采用免疫组化方法检测了82例乳腺癌患者P-gp的表达，并分析了临床病理特征与患者预后的关系，结果显示P-gp表达水平与P-gp表达水平密切相关。乳腺癌患者的预后，表达水平越高，生存率越低。在本研究中，P-gp在正常宫颈组织中不表达，在宫颈癌组织中高表达，有效化疗患者化疗前P-gp阳性表达率低于无效化疗患者。与先前研究的结果一致。此外，本研究还表明，经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞后P-gp表达水平显著升高，表明化疗可诱导宫颈癌组织中P-gp的表达，P-gp可能接近二级耐药。

表3 化疗前P-gp表达与化疗效果的相关性

图2 β-Globin PCR产物电泳图

表2 介入栓塞化疗前后正常组织和宫颈癌组织P-gp表达水平的比较

表4 扩增子中的CpG岛和相应的CpG基因座

图3 化疗前后正常宫颈组织和宫颈癌组织中MDR1基因CpG岛的平均甲基化率

图4 不同化疗疗效患者MDR1基因CpG岛的平均甲基化率

DNA甲基化是肿瘤的潜在生物标志物。通常，DNA甲基化可以抑制基因表达，全基因组的低甲基化是肿瘤细胞最重要的特征之一[15]。MDR1低甲基化导致肿瘤细胞P-gp的最高表达，从而降低肿瘤细胞对化学治疗剂的敏感性[16]。Bebek等[17]认为头颈部鳞状细胞癌中MDR1启动子区的甲基化水平与正常黏膜组织不同，与肿瘤区淋巴结转移密切相关。在本研究中，化疗前宫颈癌组织中6个CpG岛的甲基化率高于化疗后，有效化疗患者化疗前CpG_2，3和4位点的甲基化率高于无效患者。化疗可能改变MDR1基因甲基化状态，化疗效果与MDR1基因甲基化状态有一定的相关性。此外，正常宫颈组织中13 CpG岛的平均甲基化率高于宫颈癌组织（P＜0.05），说明MDR1 CpG岛的定量甲基化可能是宫颈癌的分子标志物，进一步为宫颈癌的鉴别提供指导。本研究主要探讨P-gp蛋白为标记物的MDR1甲基化对化疗耐药的影响，不涉及临床终点，且耐药机制与突变有关，故无需用多因素回归统计分析。

虽然我们得到了一些有趣的结果，但也有一些局限性。首先，MDR1基因CpG位点的甲基化状态是否能够识别恶性程度还有待进一步研究。其次，MDR1的CpG位点能否用于肿瘤的临床诊断还有待进一步探索。

结 论

本研究证实部分MDR1基因的甲基化状态与宫颈癌经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞的化疗疗效有一定的相关性，同时可以在一定程度上预测肿瘤的药物敏感性，并为个性化的宫颈癌治疗提供理论基础。