视网膜母细胞瘤房水及肿瘤组织的基因组信息分析初探

姜华 夏杰军 赵军阳 Fairooz 刘佩莹 张靖

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤。自2008年Abramson等[1]报道经眼动脉灌注化疗（intraarterial chemotherapy，IAC）治疗RB以来，IAC联合局部治疗（激光、球注、冷冻等）已经成为RB的重要治疗方法，提高了患儿的保眼率，但仍有部分患儿对IAC治疗不敏感，需及早摘除眼球以避免肿瘤向眼球外转移[2]。

目前，预测RB的保眼治疗的疗效仅是基于临床的肿瘤分期，包括肿瘤大小、视网膜脱落和肿瘤种植等。然而最常用的RB肿瘤国际分期（intraocular international retinoblastoma classify，IIRC）对D期RB患儿的治疗成功率的预测只有50%[3]，对E期RB患儿的预测更少[4]，因此临床亟需一种更精准的方法来评估和预测RB患儿的保眼临床疗效。

由于担心肿瘤的针道种植转移，只能从RB患儿眼球摘除后取标本行基因测序及其他生物化学检查，而不能像其他实体肿瘤一样进行活检，因此RB的基因诊断与个性化治疗受到很大限制。Jesse L等[5]发现RB房水的基因检测可以用于替代肿瘤的活组织检测来预测临床疗效，为精准治疗打开了大门[6-7]。基于此，本研究通过检测、比较RB眼球摘除后房水、肿瘤基因信息等，初步探讨RB液体活检的意义。

资料与方法

一、一般资料

本研究获得了医院伦理审查委员会批准。治疗前所有患儿监护人都获得了知情同意。本研究共纳入2例保眼失败的RB患儿。

病例1：男，5岁，右眼RB，IIRC E期，前房可见肿瘤种植，曾行1次经眼动脉灌注化疗，眼底检查示疗效较差，予以眼球摘除。

病例2：男，4岁，右眼RB，IIRC D期，曾6次全身化疗后肿瘤复发，经3次经眼动脉灌注后肿瘤控制欠佳，出现玻璃体混浊，窥不清眼底，予以眼球摘除。

二、方法

眼球摘除后先吸取房水0.5 ml，再切取少量肿瘤组织。所有样本避免溶血，取样后立即保存于-80℃冰箱内，在取样后1个月内完成检测。

分别采用Amp Genomic DNA Kit（天根）和QIAseq cfDNA提取试剂盒（Qiagen）从RB患者中提取肿瘤组织的基因组（gDNA），以及房水cfDNA。gDNA经过酶片段化，以50 ng片段化的gDNA使用KAPA hyperplus进行酶切片段化，酶切时间选择12 min，后经平末端修复，5’磷酸化和3’加腺苷酸尾、DNA连接酶等模块连接Illumina Truseq 接头后通过P5、P7端引物扩增后得到上机文库。房水中分离的cfDNA采用相同的NGSDNA文库制备方法，但前期无片段化处理过程，采用10 ng cfDNA构建测序文库。纯化的测序文库由Illumina noveseq 6000平台进行全基因组低覆盖度的高通量测序。在获得测序原始数据后，每条测序序列以95%以上碱基质量≥28分为阈值基准，利用Fastp质控及过滤工具（https://github.com/OpenGene/fastp）进行过滤，通过质控标准的片段序列（reads）进一步运用BWA软件（http://biobwa.sourceforge.net/bwa.shtml）与人参考基因组（hg19）进行比对。根据比对结果，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度。采用ichorCNA（https://github.com/broadinstitute/ichorCNA/）对样本的染色体拷贝数变异和肿瘤分数进行分析。ichorCNA是一种基于隐马尔可夫模型（HMM）预测超低通量全基因组测序（ulp-wgs）的染色体拷贝数变异和肿瘤分数(tumor fraction，TFx)的方法。

本研究采用ichorCNA以1 Mbp为长度单位将基因组分割成不相重叠的窗口（1m-bin），在分析过程中过滤DNA重复区域、低覆盖区域及GC校正后，提取每个窗口中reads数目，将常染色体平均reads数设为标准对照，计算每个窗口中样本与标准对照的reads数的倍数关系，作log2 ratio值计算，预测每个样本中的肿瘤DNA含量以及拷贝数变异。

结 果

一、样本的质量评估

两个病例的肿瘤组织和房水样本的DNA质量良好（图1～2）。

二、全基因低覆盖度测序和染色体拷贝数变异分析

图1 两个肿瘤组织样本的DNA质量良好

图2 房水的cfDNA质量良好，cfDNA片段大小在理想范围内

以人的基因组hg19作为参考基因组对测序结果进行比对。hg19基因组大小是3 095 677 412 bp，有效基因组大小为2 861 327 131 bp（参考序列中不含N）。我们应用BWA软件，分别将各个样本的测序数据比对到参考基因组上。4个样本的有效reads比对率介于78.22%～88.23%之间，平均测序深度介于0.27 X～0.36 X之间。

图3显示了所有染色体的每个1M-bin的聚集归一化覆盖率统计的结果。两个患者的房水cfDNA中，最常见的拷贝数增加的基因组区域包括1q、6p和13q，最常见的拷贝数缺失区域包括6q、8p。

在病例1患儿中，房水和肿瘤样本的基因组拷贝数增加的区域高度一致，都出现了1q、6p以及13号和18号全染色体区域的扩增。肿瘤组织在15q区域也有显著的拷贝数增加。分析显示病例2患儿的肿瘤组织比例过低（TF=0.09 276），因此低覆盖度高通量测序未能很好地反应其染色体拷贝数变异的情况。该患儿房水样本在1p、6q、8p和13q区域有基因组拷贝数变异，在17p和19q染色体区域出现了微缺失区域。

讨 论

图3 肿瘤和前房液ichorCNA分析结果

早发现、早诊断、早治疗能够降低视网膜母细胞瘤患儿的死亡率、提高其保眼率，乃至保留有用的视力。经眼动脉灌注化疗、玻璃体腔注射化疗等保眼治疗方法的出现，提高了患儿的保眼率，使得大量以往需摘眼球的患儿得以保存眼球，也使得这部分患儿不能以病理检查来评估疾病扩散以及预后的危险因素，因次找到更加精准的RB诊断工具对RB保眼治疗的疗效以及预后评估变得非常迫切。

与其他部位的恶性肿瘤相比，RB的一个显著区别在于，其临床分期不是基于病理检查或者活检，也无任何遗传肿瘤标记物的参考。 尽管如此，通过研究眼球摘除后的肿瘤发现：绝大多数视网膜母细胞瘤（98%）是由13q染色体上RB1肿瘤抑制基因的两个等位基因失活引起的，RB体细胞拷贝数主要改变表现为1q、2p、6p 染色体拷贝数增加，13q、16q 染色体缺失以及2p 染色体局部扩增[8]。有学者研究发现1q、6p拷贝数增加和16q缺失可能与局部侵袭性疾病有关[9]；而且 6p拷贝数增加与分化程度较低的肿瘤有较高的视神经侵犯率有关[10]。然而，由于为了避免RB的眼外肿瘤转移而禁止侵入性组织活检，从而限制了这些研究结果的临床应用，不能评估和预测RB的保眼率。

1971年，Dias等[11]首先在RB患儿摘除后的眼球房水中发现了乳酸脱氢酶（LDH），且活性的增加与疾病的进展有关，作者认为这可能有助于诊断。在该初步报告之后几十年中，许多研究都在眼球摘除后检测房水，并发现了各种标记物，为诊断、临床病理相关性及可能的靶向治疗做出有益的探索，但是，由于这些研究都是从眼球摘除后的眼中进行的，因此房水检测在RB的诊治中的作用仍然有限。

Berry等[5]在晚期RB患儿的房水中发现了RB肿瘤游离DNA，且与眼球摘除后肿瘤组织获得的基因组图谱一致，该研究表明房水基因检测有可能替代肿瘤活检，直接作为肿瘤诊断的金标准，并且提示肿瘤遗传信息。而且进一步的后续分析表明，RB患儿房水中cfDNA的基因组评估具有重大的预后潜力[12]。在该研究中，8位RB患儿房水的cfDNA浓度范围为0.084～56 ng/ul，接受美法仑治疗的患眼的平均cfDNA浓度为0.2 ng/ul，而未经治疗直接眼球摘除的房水内的肿瘤的浓度要高得多（平均43.6 ng/ul）。此外，房水cfDNA检测中发现6p染色体的增加与肿瘤活性有关，提示这可以作为保眼治疗失败致眼球摘除的预测方法。房水的基因检测为RB保眼治疗的疗效评估和预后预测开启了精准治疗的大门[13]。经过对两例患儿眼球摘除后房水、肿瘤组织的基因信息比对，发现这两种组织的基因组图谱一致，并且与Berry团队的研究基本相似。

综上，尽管本研究只有2例标本，但是结果仍是令人振奋的，国内首次在RB患儿房水中提取cfDNA，期待进一步研究来预测肿瘤的疗效和预后，这将大大改善视网膜母细胞瘤的临床实践，房水活检有望成为视网膜母细胞瘤诊断治疗的新标准，使得RB的精准治疗成为可能。

致谢：感谢洛杉矶儿童医院Jesse L.Berry、Liya Xu教授以及上海福君基因生物科技有限公司对本研究的支持和帮助。