基于响应面法的连翘果实总黄酮闪式提取工艺优化

邱相坡，梁 璇，王文斌

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

连翘（Forsythia suspense）是木犀科（Oleaceae）连翘属（Forsythia）落叶灌木，适宜生长在灌木丛、林下、草丛或山谷疏林中[1]。连翘在我国分布较广，除华南地区外其他各地都有栽培，多分布在山东、山西、陕西、河南、四川等地[2]。连翘果实多呈长卵形、卵形等，表面具不规则纵皱纹和凸起的斑点，顶端锐尖[3]。青翘是连翘的一种，果实刚成熟且尚带绿色时采收得到，采收期一般在10 月下旬，其表面呈绿褐色，气微香，味苦[4]。

连翘具有清热解毒、疏散风热、消肿散结的作用[5]，可用于外感风热、温病发热、疮疡肿痛等症状，它具有良好的药理作用，如抗炎、抗病原微生物、解热、利尿等[6-9]。同时，大量临床研究证实，连翘对中度和轻度抑郁症有效，其副作用较传统的抗抑郁药物更温和[10]。

黄酮类化合物是连翘果实中主要有效成分之一，由色原烷或色原酮衍生而来，广泛分布在植物的各个部位，是植物中的次级代谢产物[4]。黄酮类化合物可调节脂质代谢、降低血清胆固醇、清除生物体内自由基、改善血液循环、抗肝脏毒性等，同时能够增强免疫力，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，对治疗心血管疾病也有一定效果[10]，在食品、药品、保健品等方面应用广泛。

黄酮类物质种类多且分布广，对它进行提取有许多方法，如超声辅助有机溶剂提取法、微波辅助法、超临界流体萃取法、超声波提取法、纤维素酶解法、浊点萃取法、大孔树脂吸附法等[4，11-13]，这些方法分别在不同程度上存在安全性不足、对温度要求严格、操作流程复杂、用时较长、应用范围有限、分离效果差等缺点。而闪式提取法利用高速剪切搅拌振动、超动分子渗滤与负压过滤等技术，在室温和溶剂存在下，把植物药用部位在几秒内破碎成细颗粒，在短时间内使组织细胞内外的有效成分达到动态平衡，最后用过滤的方法实现总黄酮提取[14]。闪式提取法用时短、效率高，在常温条件下即可完成，使用方便且不受热破坏，适用范围广泛，能最大限度地保留植物有效成分，结构紧凑，使用安全可靠[15]。

响应面法（RSM）利用合理试验获得数据构建多元二次回归方程，分析得到最优工艺参数。可用于解决多变量问题，在生物学、化学、食品科学等领域广泛应用。相较于传统的正交设计等方法，响应面法构造了明确的函数表达式，得到的最优方案更精确。

本试验首次利用闪式提取法提取连翘果实中的总黄酮，选取液料比、闪式提取时间、闪式提取电压这3 个单因素，利用响应面法建立模型，为优化连翘果实中黄酮的工业提取工艺提供一定的理论参考，也为提升黄酮的利用价值、获得更高的经济收益提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试连翘品种为青翘，采购于山西省临汾市古县。将连翘放入60 ℃干燥箱中烘干以除去水分，直至用电子天平称量为恒质量。将干燥后的连翘果实通过粉碎机粉碎成粉末，过0.42 mm 筛，密封入洁净的蓝盖瓶，储存于4 ℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线制作方法 取芦丁标准品20.00 mg，加入适量60%乙醇，振荡摇晃以充分溶解，完全转移并用60%的乙醇定容到100 mL，得到0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，存放于4 ℃冰箱备用[2，16]。

取6 个25 mL 容量瓶，分别加入0、1、2、3、4、5 mL 芦丁标准液，加入5%NaNO2溶液各0.3 mL，摇匀并静置6 min；再加入10%Al（NO3）3溶液各0.3 mL，摇匀静置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用60%乙醇定容至25 mL，摇匀，静置15 min[17]，以不含芦丁标准液的溶液为空白对照，在510 nm 波长下测吸光度值，生成芦丁标准曲线[11]。

1.2.2 连翘果实总黄酮的提取 准确称取2.00 g上述连翘果实粉末于蓝盖瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，用闪式提取器在110 V 电压下提取80 s。将得到的悬浊液完全转入50 mL 离心管中，经6 000 r/min离心6 min，将上清液转入洁净的蓝盖瓶，即可得到连翘果实试液，存放于4 ℃冰箱中，待测。

1.2.3 连翘果实总黄酮的测定 精密量取连翘果实试液2 mL，移入25 mL 容量瓶中，用移液枪吸取0.3 mLNaNO2溶液，加入容量瓶中，摇匀，静置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀静置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用60%乙醇定容至25 mL，摇匀并静置15 min。将容量瓶中的溶液移入离心管中，经6 000 r/min 离心6 min 后，转移上清液至洁净的蓝盖瓶内，稀释10 倍后在510 nm 波长处测定吸光度值，并计算提取率。

式中，E 为总黄酮提取率；C 表示提取液中的总黄酮浓度（mL/g）；V 表示提取液的体积（mL）；n 表示提取液的稀释倍数；m 表示配制连翘果实试液时使用的药粉质量（g）。

1.3 单因素试验

1.3.1 液料比试验 确定试验所用液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，由于需要将闪式提取器破碎提取刀头浸入试液液面以下，在洁净的蓝盖瓶中分别准确称取4.00、3.00、2.00、2.00、2.00 g连翘果实粉末，并分别加入40、45、40、50、60 mL 的60%乙醇溶液，摇匀，在闪式提取电压100 V 的条件下提取90 s。将获得的试液转入50 mL 离心管中，经6 000 r/min 离心6 min 后，将上清液分别倒入5 个洁净的蓝盖瓶，密封储存在4 ℃冰箱中待测。

准备6 个洁净干燥的25 mL 容量瓶，向其中5 个分别加入上一步制得的连翘果实试液各2.00 mL，另外1 个容量瓶作为对照。用移液枪分别量取5%NaNO2溶液0.3 mL 加入容量瓶中，摇匀并静置6 min；分别加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀静置6 min；再分别向各个容量瓶中加入4%NaOH 溶液4 mL，并用60%乙醇定容，摇匀，静置15 min。将所得的溶液转入离心管，6 000 r/min 离心6 min 后得到上清液。将其稀释10 倍并检测510 nm 波长下的吸光度。计算连翘果实中总黄酮提取率，确定最佳液料比。

1.3.2 乙醇浓度试验 设置闪式提取时间、闪式提取电压、连翘果实试液液料比分别为90 s，110 V，25∶1。向5 个蓝盖瓶中分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，剩余步骤同1.3.1，确定最佳乙醇浓度。

1.3.3 闪式提取时间试验 设置闪式提取电压、连翘果实试液液料比、乙醇浓度分别为110 V，25∶1，60%。分别闪式提取70、80、90、100、110 s，剩余步骤同1.3.1，确定最佳闪式提取时间。

1.3.4 闪式提取电压试验 设置闪式提取时间、连翘果实试液液料比、乙醇浓度分别为80 s，25∶1，60%。分别在90、100、110、120、130 V 下提取，剩余步骤同1.3.1，确定最佳闪式提取电压。

1.4 响应面试验设计

分析单因素试验结果可以得出，液料比、闪式提取时间和闪式提取电压这3 个单因素对连翘果实中黄酮类物质的提取率有较大影响。利用Design-Export 8.0.6 软件中的Box-Behnken 程序，进行三因素三水平的试验设计，以确定连翘果实中总黄酮提取的最佳工艺。所设计的试验因素及编码列于表1。

表1 响应面试验因素及编码

1.5 统计分析方法

整个试验过程均至少重复3 次，并采用Microsoft Excel 及SPSS 17.0 进行标准差计算及显著性差异分析。单因素试验中连翘总黄酮提取率结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 绘制芦丁标准曲线

图1 结果显示，芦丁标准曲线的回归方程为y＝9.025x-0.003（R2＝0.999 6）。其中，自变量x 代表芦丁质量浓度（mg/mL），因变量y 为吸光度A。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 液料比对连翘果实总黄酮提取率的影响由图2 可知，当液料比为10∶1～25∶1（mL/g）时，连翘果实总黄酮的提取率呈现上升的趋势；而在25∶1～30∶1 的区间则呈现缓慢下降的趋势，液料比为25∶1 时，连翘果实试液中总黄酮达到峰值。因此，可选择连翘果实试液的液料比25∶1 作为最适液料比。

2.2.2 乙醇浓度对连翘果实总黄酮提取率的影响对图3 的分析表明，乙醇浓度在40%～50%时连翘果实总黄酮的提取率平缓上升，在50%～60%提取率几近持平而略有极小幅的升高，高于60%则呈下降趋势。因此，乙醇浓度为60%时连翘果实总黄酮的提取率达到峰值。

2.2.3 闪式提取时间对连翘果实总黄酮提取率的影响 分析图4 可知，提取时间为70～80 s 时，连翘果实总黄酮的提取率较大幅上升，在80～90 s 有明显的下降趋势，而在90 s 之后连翘果实总黄酮提取率的下降渐渐趋于平缓。因此，提取时间为80 s时连翘果实黄酮提取率最高。

2.2.4 闪式提取电压对连翘果实总黄酮提取率的影响 分析图5 可知，提取电压为90～110 V 时，连翘果实黄酮的提取率呈现上升的趋势，电压在110 V 后连翘果实的提取率呈现下降趋势。因此，提取电压为110 V 时连翘果实黄酮提取率最高。

2.3 响应面结果分析

对闪式提取连翘果实中总黄酮的条件进行优化，试验方案及其结果列于表2。

表2 试验设计及测定结果

分析表2 中的数据可得如下回归方程。

式中，Y 表示连翘果实总黄酮提取率。

对回归方程进行方差分析，结果列于表3。对回归方程以及表3 中数据进行分析，可得失拟项＝0.104＞0.05，说明该模型拟合程度良好；均方差P＜0.000 1，小于0.05，表明回归模型显著。CV＝1.11%，说明试验精确度良好；信噪比＝15.732＞3，表明该模型对连翘果实中总黄酮提取率的分析和预测结果较为准确；R2＝0.981 2，表明该模型拟合程度较高。

表3 回归方程的方差分析

对回归模型进行显著性分析，所得模型的一次项A、C 显著（P＜0.05），B 不显著（P＞0.05），二次项A2、B2、C2均显著（P＜0.05）。各单因素对连翘果实总黄酮提取率的影响大小：A＞C＞B，即连翘果实试液液料比＞闪式提取电压＞闪式提取时间。

2.4 多因素间交互作用分析

由图6～8 可知，连翘果实试液液料比和闪式提取时间2 个因素之间存在明显的交互作用，连翘果实试液液料比与闪式提取电压之间也有着较为明显的交互作用，而闪式提取时间与闪式提取电压之间交互作用不明显。连翘果实总黄酮提取率受连翘果实试液液料比的影响最大，在25∶1～30∶1的某点提取率最高，闪式提取电压在100～110 V的某电压下连翘果实总黄酮提取率最高，而闪式提取时间在70～80 s 的某时刻有最高提取率。

2.5 验证试验结果分析

根据Design Expert 8.0.6 软件优化分析获得从连翘果实中提取总黄酮的最优工艺如下：液料比为27.34∶1、闪式提取时间为79.84 s、闪式提取电压为108.87 V，在此条件下，连翘果实总黄酮提取率理论值为18.256%。由于仪器精度等条件的限制，故采用连翘果实试液液料比为27∶1、闪式提取时间为80 s、闪式提取电压为109 V 进行3 次验证试验，得到连翘果实总黄酮提取率实际均值为18.030%，较为接近响应面软件分析所得到的理论值。由此可认为，此试验模型选择合理，试验结果理想。

3 结论与讨论

在研究乙醇浓度这一单因素时发现，乙醇浓度对连翘果实总黄酮提取率的影响不大。乙醇浓度较低时提取率与乙醇浓度基本成正比，乙醇浓度在50%～60%时达到最高值并保持基本持平，而后逐渐下降，考虑到节能、高效等因素，在设计响应面试验时舍去该单因素[18-20]。

响应面法分析得出利用闪式提取法提取连翘果实中的总黄酮最优工艺为：液料比27.34∶1，提取时间为79.84 s，提取电压为108.87 V，此条件下所得理论提取率为18.256%。利用超声提取法提取连翘果实中总黄酮的试验所得到的最佳提取工艺为：超声功率66.2%，温度57.2 ℃，乙醇浓度56.2%，超声提取40 min，所得理论最佳提取率为15.08%[19]。比较2 种提取方法，可以发现，闪式提取法所需时间更短，室温下即可进行提取，操作简单易行，并且可以获得更高的提取率。

此外，正交试验设计也广泛应用于优化提取工艺中[1，21-23]，但它作为线性数学模型所设计的设计方法，只能分析离散性数据。响应面法则采用非线性模型，可以在给出的区域找到明确的回归方程，从而找到整个区域提取工艺的最优值，预测性更好。

通过单因素试验以及响应面设计模型，比较液料比、闪式提取时间、闪式提取电压等条件对连翘果实总黄酮提取率的影响，得到闪式提取连翘果实中总黄酮的最优方案。结果表明，各单因素对提取率的影响为：液料比＞闪式提取电压＞闪式提取时间。从连翘果实中提取黄酮的最优工艺：液料比为27∶1、闪式提取时间为80 s、闪式提取电压为109 V，连翘果实总黄酮提取率的实际均值为18.030%。研究结果可为优化连翘果实中总黄酮的提取工艺提供一定的理论参考。