γ氨基丁酸对黄秋葵采后品质及生理特性的影响

殷菲胧,乔 沛,李 静,王秀丽,董新红

(桂林理工大学化学与生物工程学院,广西桂林 541004)

黄秋葵(Abelmoschusesculentus(L.)Moench),被称为蔬菜之王,深受岭南地区大众所喜爱[1]。黄秋葵本身水分含量高、表面积大,极易失水、衰老、褐变及纤维化,严重影响其商品价值,因此,研究黄秋葵的贮藏保鲜具有一定的实际应用价值,目前主要集中在物理(气调和冷藏)方面。辛松林等[2]研究表明,气调可以有效的改善采后黄秋葵冷藏期间感官品质,延缓黄秋葵衰老。真空冷藏能明显降低黄秋葵失重率及推迟呼吸高峰出现,延缓可溶性糖含量下降[3]。但气调库一次性投资较大,贮藏成本偏高;低温贮藏则物流成本偏高,需要投入大量人力、物力和财力。而采用化学方法又由于化学物质残留对人体具有毒副作用而受到限制。因此,寻找一种安全有效的生物保鲜技术就显得尤为重要。

果实的采后衰老是贮藏过程中普遍存在的一种现象,不仅影响其外观,同时还会造成其风味和营养的劣变。果实的采后衰老是由内在和外部环境因素所诱导和引起的一种主动过程,活性氧(ROS)的累积造成的膜脂过氧化损伤是生物体衰老的主要诱因[4]。正常机体内活性氧代谢处于平衡稳定,不仅不会对机体造成损害,还能起到一定的信息传递功能[5],但采后果蔬处于逆境胁迫条件下,富集的活性氧得不到有效清除,造成脂质、蛋白质及核酸的过氧化链式反应,加速果蔬的衰老褐变[6]。因此,果蔬采后品质降低与活性氧代谢引起的生理反应密切相关,而良好的保鲜技术和方法可以有效减少活性氧的积累,减轻过氧化对膜质的损伤,从而延缓果蔬的衰老和劣变。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳氨基酸[7],能有效减轻活性氧的积累,缓解逆境对有机体的伤害,并提高机体保护酶的活性[8]。外源GABA能够促进桃[9-10]、甜瓜和香蕉[11]等果蔬内源GABA累积,增加抗氧化系统酶活性和保持能量水平,提高果实的抗逆性。目前GABA在采后黄秋葵常温贮藏品质及生理特性的影响还未见报道。本研究采用GABA对采后黄秋葵进行处理,首先对黄秋葵失重率、叶绿素含量和VC含量进行分析,进而考察了GABA处理对黄秋葵抗氧化酶系活性、活性氧膜质过氧化产物的影响,旨在探讨GABA处理维持黄秋葵的采后品质,延缓其衰老的可能机理,为GABA作为保鲜剂的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

黄秋葵 桂林市某农贸市场,挑选新鲜、完整、无破损的黄秋葵备用;GABA(99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;咪鲜胺(45%) 湖南新长山农业发展股份有限公司;所有实验用化学试剂 均为国产分析纯。

DK-S24电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;SQP电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;UV1800紫外分光光度 岛津仪器(苏州)有限公司;FA2004C分析天平 上海越平科学仪器有限公司;H2050R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;Revco Ex F24086V超低温冰箱 美国Thermo公司;LHS-250HC-Ⅱ恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 黄秋葵经清水处理晾干后,先用0.1%的咪鲜胺水溶液浸泡3 min后,每组70个,分别在5、10、15 mmol/L的GABA水溶液中充分浸泡3 min,以清水处理为对照,涂层均匀后,自然晾干,分别于常温条件(25 ℃)下贮藏。每3 d取样(10个),当天测定失重后液氮冷冻打粉并低温贮藏,用于测定其余指标。

1.2.2 失重率的测定 失重率参照帅良等[12]方法,每组3个,共4组,采用称重法,按式(1)计算。

式(1)

式中:M1代表采样0 d质量,g;M2代表每次取样质量,g。

1.2.3 叶绿素含量测定 叶绿素含量测定参照李丽等[13]采用丙酮提取法,重复3次,分别测定提取液在663和645 nm处吸光值,根据Arnon公式,得总叶绿素含量,按式(2)计算。

式中:v代表采样提取液总体积,mL;m代表取样质量,g；20.29和8.05均为Arnon公式中由吸光系数分别得到的相关系数。

1.2.4 VC含量测定 VC含量测定参照李静等[14]方法,采用2,6-二氯酚靛酚钠滴定法测定抗坏血酸,含量用mg/100 g表示。

2,6-二氯酚靛酚钠溶液标准滴定:以10 mL 0.1 mg/mL标准抗坏血酸溶液置于锥形瓶中,用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至微红色,15 s不褪色即为滴定终点,根据消耗的2,6-二氯酚靛酚钠溶液的量,计算出1 mL染料溶液相当于抗坏血酸质量(ρ)。每次取样均重复测3次。

样品提取测定:取预冷50 mL离心管,称取2 g秋葵粉,然后加入15 mL 20 g/L预冷的草酸溶液,旋涡振荡30 s,冰浴静止提取10 min,4 ℃下12000 r/min离心10 min,取10 mL上清液用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至微红色,15 s不褪色即为滴定终点,记下此时染料用量。同时以10 mL草酸溶液(20 g/L)作为空白,按照同样方法进行滴定。以上操作重复3次。VC含量按式(3)计算。

式(3)

式中:V1代表样品滴定消耗染料体积,mL;V0代表空白滴定滴定消耗染料体积,mL;ρ代表1 mL染料溶液相当于抗坏血酸的质量,mg/mL;VS代表滴定时所取样品溶液体积,mL;V代表样品提取液总体积,mL;m代表样品质量,g。

1.2.5 丙二醛含量测定 丙二醛含量测定参照Zhang等[15]采取TBA显色法测定并稍作修改。取预冷50 mL离心管,称取2 g秋葵粉,然后加入10 mL预冷10% TCA溶液旋涡振荡30 s,冰水浴静置提取10 min,4 ℃下12000 r/min离心20 min,取上清液2 mL,加入2 mL的TBA溶液并在沸水浴加热20 min,降至室温,于5000 r/min离心15 min,取上清液,以0.6%的TBA溶液为空白,测量其在532、600和450 nm处的吸光度。以上操作重复3次。按式(4)计算:

MDA含量(μmol/g)={[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]×V}/(VS×m×1000)

式(4)

式中:V代表提取液总体积,mL;VS代表测定时所取样品提取液体积,mL;m代表样品质量,g。

1.2.6 过氧化物酶(POD)活性测定 取预冷50 mL离心管,称取2 g秋葵粉,然后加入10 mL预冷0.1 mol/L pH5.5乙酸缓冲液(含1 mmol/L PEG、4% PVP和1% Trriton X-100)旋涡振荡30 s,冰水浴静置提取10 min,4 ℃下12000 r/min离心30 min,取上清液,低温保存备用。过氧化氢酶活性参考Chu等[16]进行测定,以上操作重复3次。

1.2.7 过氧化氢酶活性及超氧化物歧化酶活性测定 取预冷50 mL离心管,称取2 g秋葵粉,然后加入10 mL预冷0.1 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(含5 mmol/L DTT和5% PVP)旋涡振荡30 s,冰水浴静止提取10 min,4 ℃下12000 r/min离心30 min,取上清液,过氧化氢酶活性参考Gao等[17]的方法进行测定;超氧化物歧化酶活性测定参考Chen等[18]的方法进行测定,以上操作重复3次。

1.3 数据处理

实验结果采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(Duncan法,显著水平P<0.05)和因子分析,采用OriginPro 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 GABA处理对黄秋葵失重率的影响

果实失重率是评价采后果蔬贮藏品质,反映采后果实内容物消耗速率的重要指标[12]。如图1所示,随着贮藏时间的延长,黄秋葵的失重率均呈逐渐上升趋势,其中对照组21 d失重率最高为11.1%。5和10 mmol/L的GABA处理能明显减缓采后黄秋葵的水分损失,尤其贮藏前期(3～12 d)的果实失重率与对照组有显著差异(P<0.05),其中5 mmol/L的GABA处理组效果最好,在21 d时失重率仅为8.7%。与对照相比,15 mmol/L的GABA处理则促进了黄秋葵水分损失,表现为失重率提高。说明低浓度GABA处理对于减少黄秋葵货架期的水分损失,对保持其新鲜品质具有较好效果。

图1 GABA处理对黄秋葵失重率的影响Fig.1 Effect of GABA treatment on the weight loss rate of okra注:*表示10 mmol/L GABA与CK组存在显著差异(P<0.05);**表示10 mmol/L GABA与CK组存在极显著差异(P<0.01);无标识表示无显著差异,全文同(通过最终分析10 mmol/L GABA效果最好,因此显著差异只标注10 mmol/L GABA)。

2.2 GABA处理对黄秋葵叶绿素含量的影响

叶绿素广泛存在于植物及果蔬中,其含量的降低会造成果蔬出现严重的黄化现象,影响其商品价值[19]。由图2可知,在常温贮藏期间,对照组和处理组叶绿素含量在贮藏过程中不断下降,对照组叶绿素含量由0 d的0.1269 mg/g降为21 d的0.0745 mg/g,降低41.3%。10 mmol/L GABA处理效果最好,叶绿素含量3 d后一直极显著高于对照组(P<0.01),从0 d的0.1269 mg/g降至21 d的0.1025 mg/g,降低19.2%,且21 d叶绿素含量为对照组的137.58%。说明10 mmol/L GABA处理能减缓叶绿素的降解,使黄秋葵果荚保持良好的外观品质。5和15 mmol/L的GABA处理虽然也能抑制叶绿素含量降低,但与对照组差异不显著。

图2 GABA处理对黄秋葵叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of GABA treatment on chlorophyll content of okra

2.3 GABA处理对黄秋葵VC含量的影响

VC作为还原性物质,可消除和减轻活性氧等自由基对细胞的伤害[19],通过测定其含量可以反映采后黄秋葵生理状况[20]。由图3可知,所有处理组黄秋葵的VC含量均在贮藏过程中逐渐下降。对照组的VC含量下降幅度最大,由0 d的13.30 mg/100 g降至21 d的3.61 mg/100 g,下降72.9%;而10 mmol/L GABA处理组效果最佳,VC含量显著高于对照组(P<0.05),VC含量由0 d的13.30 mg/100 g降至21 d的6.11 mg/100 g,下降54.1%。与对照相比,在贮藏末期(21 d),各种浓度的GABA处理均能明显提高黄秋葵的VC含量,10 mmol/L GABA处理组VC含量为对照组的169.2%,具有极显著差异(P<0.01)。说明GABA处理能有效减缓黄秋葵中VC的降解,维持较高水平的VC含量,保持黄秋葵果荚良好的营养品质。

图3 GABA处理对黄秋葵VC含量的影响 Fig.3 Effect of GABA treatment on VC content of okra

2.4 GABA处理对黄秋葵丙二醛(MDA)含量的影响

MDA是脂质过氧化的主要产物之一,其含量的多少可作为采后秋黄葵贮藏期间衡量细胞膜透性和稳定性的重要指标之一[21]。由图4可以看出,在常温贮藏过程中,对照组黄秋葵中MDA含量呈逐渐升高趋势(由0 d的5.1×10-3μmol/g上升至21 d的11.97×10-3μmol/g),不同处理组MDA含量均呈先增加后稍降的趋势,且MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)。在低温贮藏的鲜切石榴[22]和低O2高CO2处理后贮藏的白玉枇杷[23]的贮藏过程中,发现类似的MDA变化现象。因此,GABA处理能明显延缓黄秋葵贮藏过程中细胞膜脂质过氧化进程,降低膜脂过氧化对细胞的损伤,减慢衰老褐变的速度,有助于延长黄秋葵采后的货架期。

图4 GABA处理对黄秋葵丙二醛(MDA)含量的影响Fig.4 Effect of GABA treatment on malondialdehyde(MDA)content of okra

2.5 GABA处理对黄秋葵过氧化物酶(POD)活性的影响

过氧化物酶(POD)可以催化过氧化氢的氧化反应,加速果蔬衰老褐变[24]。由图5可知,15 mmol/L GABA处理组与对照组POD活性变化基本一致,呈先上升后降低的趋势且贮藏前期(0～9 d)显著(P<0.05)低于对照组,贮藏后期则与对照组差别不大。5 mmol/L的GABA处理组POD活性呈逐渐下降趋势,一直低于对照组,且在0～9 d呈现显著差异(P<0.05),12 d之后无显著性差异(P>0.05);10 mmol/L GABA处理组POD活性逐渐下降且15 d之前显著低于对照组(P<0.05),18 d无显著差异。与对照相比,不同浓度的GABA处理会不同程度降低黄秋葵的POD活性,这与热激处理的鲜切甜椒[25]和褪黑素处理的荔枝[15]中POD活性变化一致。结果表明不同浓度GABA处理(15 mmol/L处理后期除外)均可以明显降低POD活性,尤以10 mmol/L GABA处理效果最佳。

图5 GABA处理对黄秋葵过氧化物酶(POD)活性的影响Fig.5 Effect of GABA treatment on POD activity of okra

2.6 GABA处理对超氧化物歧化酶(SOD)活性

图6 GABA处理对黄秋葵超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响Fig.6 Effect of GABA treatment on SOD activity of okra

表1 各生理指标间的相关性分析Table 1 Correlation analysis of all physiological indexes

2.7 GABA处理对过氧化氢酶(CAT)活性

CAT催化H2O2生成无毒性的水和分子氧从而降低活性氧自由基对组织细胞的损害,延缓果蔬的衰老,CAT活性可以反映采后果蔬对抗胁迫反应的能力[27]。由图7可知,不同处理组CAT活性变化基本一致,呈逐渐下降的趋势,其中5和10 mmol/L的GABA处理组高于对照组,尤其是10 mmol/L的GABA处理组效果具有极显著差异(P<0.01),5 mmol/L的GABA处理后期(9 d之后)效果明显(P<0.05),而15 mmol/L GABA处理组与对照组无显著差异(P>0.05)。说明适宜浓度的GABA(5和10 mmol/L)处理可提高黄秋葵果荚中CAT活性,促进活性氧清除,降低膜脂过氧化,从而保持果荚的良好品质。

图7 GABA处理对黄秋葵过氧化氢酶(CAT)活性的影响Fig.7 Effect of GABA treatment on CAT activity of okra

2.8 相关性分析

对黄秋葵保鲜的各生理指标进行相关性分析,结果如表1所示。黄秋葵贮藏时间和失重率、MDA含量呈极显著正相关(P<0.01),与叶绿素含量、VC含量、CAT活性和POD活性呈极显著负相关(P<0.01)。该结果进一步说明随着贮藏的进行,果实的失水率也逐渐提高,叶绿素和VC逐渐降解,酶活性降低不足以及时清除植物体内产生的活性氧,随着活性氧积累,膜脂过氧化损伤加剧,导致黄秋葵果荚的外观和食用品质下降,直至最后衰老变质。

2.9 主成分分析

主成分分析旨在利用降维的思想使问题简单化,同时得到更加科学有效的数据信息。目前关于采后果蔬贮藏品质方面应用较少,因此本文采用主成分分析法,以综合评价指数来判定不同处理组在常温贮藏过程中果蔬品质的变化。由表2可知,对黄秋葵保鲜过程中的指标进行标准化处理之后进行主成分分析,第1、2主成分特征值分别为4.663和1.189,第1、2主成分贡献率分别为66.62%和16.984%,前2个主成分特征值均大于1且累积贡献率达到83.604%,可见前2个主成分可以说明秋黄葵采后常温贮藏期间有关数据的变化趋势,完全符合主成分分析的基本要求,因此取前2个主成分进行数据分析。

表2 各指标特征值及方差贡献率Table 2 Characteristic values and variance contribution rate of each indicator

由表3可知可用2个变量Y1、Y2代替原来的7个指标,得出线性组合为(其中Z1～Z7均为标准化变量):

同时以选取的第1、第2主成分的方差贡献率α1(66.62%)、α2(16.984%)作为权数,构建综合评价模型:F=α1Y1+α2Y2,即F=0.6629Y1+0.16984Y2。F值代表秋葵贮藏品质。

表3 各指标得分向量Table 3 Characteristic vector of each indicator

由图8可知,贮藏期间,黄秋葵综合评价指数均逐渐降低,这与实验结果中随着贮藏时间延长,黄秋葵贮藏品质逐渐下降相一致,其中GABA处理组相比对照组明显延缓了黄秋葵衰老进程,即在一定程度上保持了秋葵的贮藏品质,综合评定以10 mmol/L处理效果最好。

图8 GABA处理对综合评定指数的影响Fig.8 Effect of GABA treatment on the comprehensive assessment index

3 结论与讨论

研究结果表明,GABA处理在一定程度上可抑制采后黄秋葵常温储藏期间水分的损失、POD活性、活性氧产生及丙二醛含量的积累,减缓叶绿素和VC的降解。同时也不同程度提高了秋葵常温贮藏期间SOD活性和CAT活性,综合评定以10 mmol/L GABA处理效果最好。相关性分析中,叶绿素含量与VC含量极显著正相关(P<0.01),说明二者在黄秋葵采后贮藏过程中变化一致,随着黄秋葵果实的发黄老化,VC含量逐渐降低;叶绿素和VC含量变化与MDA浓度和失重率极显著负相关(P<0.01),说明MDA浓度可以直观的作为秋葵贮藏过程中贮藏品质的评价指标。主成分分析表明,随着贮藏时间的延长,黄秋葵品质相关的综合评价指数均逐渐降低,不同浓度GABA明显延缓了黄秋葵采后的品质下降,即在一定程度上保持了黄秋葵的贮藏品质。

对于不同的生理指标,三种浓度(5、10和15 mmol/L)影响效果并不完全一致。10 mmol/L对各生理指标的影响效果表现为有利于黄秋葵采后贮藏,而5和15 mmol/L总体表现不够稳定,说明选择合适的GABA浓度对果蔬进行保鲜处理也是一个很重要的考虑因素。另外,有研究表明,外源GABA处理可以刺激某些生长植株逆境胁迫条件下乙烯的产生[28-29]。那么究竟GABA处理是否刺激了刺激采后黄秋葵中乙烯的产生,黄秋葵各生理指标受不同浓度影响的变化是否与刺激乙烯合成的时间和剂量有关？这些问题还有待进一步研究。

丙二醛是ROS发生膜质过氧化的重要产物,是研究植物衰老生理和逆境胁迫生理的常用指标[20]。理论上来说,随着采后果蔬的不可逆衰老进行,果蔬中MDA含量会逐渐增多直至果实衰老腐败失去食用品质和商业价值。但在本研究中,对照组的MDA含量呈现不断上升趋势,而经GABA处理后,黄秋葵中MDA含量在贮藏前期(0～12 d)明显逐步上升,后期则开始不断下降(5 mmol/L处理组18 d后又升高)。这种现象其实在其他果实的采后贮藏过程中也有发现[22-23],可能与具体的贮藏条件和处理方式有关。

早期研究认为,可以清除植物体内的ROS防御酶系统主要有SOD、POD、CAT和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等保护酶,保护酶活性的增加,可以及时清除系统产生的活性氧自由基,避免膜脂过氧化,保护膜系统完整性,从而延缓果实衰老[30]。但近年来研究发现,POD既可将活性氧H2O2分解为H2O清除掉,也可以催化H2O2氧化,将酚类物质和类黄酮物质氧化聚合形成褐色物质,引起果蔬的衰老褐变[14]。本研究中,GABA处理对黄秋葵的SOD和CAT活性均有不同程度的提高,但却降低了其POD活性。Zhang等[15]研究也发现,褪黑素处理可以降低采后荔枝贮藏过程中的POD和PPO活性,从而有效延缓了荔枝的褐变进程。刘洪竹等[25]研究热激处理对鲜切甜椒POD活性变化影响时,也有同样发现[24]。也许POD在果蔬采后生理中的具体作用机理还需进行更多研究。

总之,合适浓度的GABA处理能有效延缓黄秋葵采后衰老,保持果荚较好的品质。GABA参与了有机体多个生物反应过程,在比较广泛剂量范围内对人体几乎无毒性,所以GABA在延缓果蔬采后衰老,保持果蔬品质方面将有良好的应用前景。