灵芝孢子粉生物活性成分及药理作用

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(1.浙江工业大学食品科学技术系,浙江杭州 310014;2.浙江百山祖生物科技有限公司,浙江丽水 323010)

灵芝(Ganodermalucidum)属于担子菌门担子菌纲多孔菌科灵芝属药用真菌[1],具有很高的药用价值,被广泛应用于治疗和预防多种心血管疾病、肝肾疾病、神经性疾病等常见的疾病[2]。尽管灵芝在我国具有非常悠久的药用历史,但是灵芝在成熟期从菌盖弹射出来的淡雾状、卵型生殖细胞即灵芝孢子直到二十世纪才得到认可和利用,灵芝孢子内含有灵芝子实体几乎所有的活性物质,包含多糖类、三萜类、蛋白质、甾醇类、核苷类、微量元素等,且部分活性物质如总三萜、总多糖含量明显高于灵芝子实体[3],同时在抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、增强免疫力[6]等方面表现出更加明显的效果,因此灵芝孢子粉已成为当前研究和开发的热点,成为保健品市场上最受消费者青睐的产品之一。本文综述了灵芝孢子粉的生物学结构、主要功能性成分、药理作用的研究进展,以期为灵芝孢子粉的进一步研究和相关技术的开发提供理论参考。

1 灵芝孢子结构

灵芝成熟后子实体木质化,皮壳组织革质化,内壁为子实层,产生孢子。灵芝孢子是灵芝的有性生殖细胞,呈卵型,褐色,大小为(5.26～6.05) μm×(7.89～8.64) μm。1962年,法国科学家Heim提出了灵芝孢子由最外孢层、周孢层、外孢层、上孢层、内孢层五层结构组成的概念,但出于实际情况考虑,研究者们将其简化为双层壁结构,即由透明的外孢壁和淡黄色或酒红色的内孢壁组成,在每个孢子的褐色内层产生许多针状小突起,深深地伸入孢子壁的透明外层,外层孢壁光滑[7],中间是一个大油滴。灵芝孢子孢壁的主要成分为几丁质,含量达52.08%～57.64%,含有Si、Ca、Fe、Mg等多种无机元素,其中Si(19.01%)和Ca(24.31%)的掺入使得孢壁更加结实坚硬,且耐酸碱,极难氧化分解,难以被人体消化分解和吸收[8-9],故灵芝孢子一般经过破壁处理后再进行食用或利用;灵芝孢子破壁后,孢子内的活性成分得以有效释放,包含多糖类、三萜类、核苷类等主要的生物活性成分,脂质类物质是其主要的内容物,具有很高的抗氧化活性[10],通过有效的提取方法可达到20%以上的提取率[11];灵芝孢子多糖的含量受灵芝的种类和生长条件的影响而有所不同,含量在1%～4%之间[12-14];灵芝孢子的蛋白质含量达18%,其中必需氨基酸含量丰富[15]。

图1 灵芝孢子结构示意图Fig.1 The structure of G. lucidum spore 注:1:孢膜;2:外孢壁;3:孢间支柱;4:内孢壁;5:孢脐;6:细胞膜;7:原生质体;8:凹陷。

图2 灵芝孢子三萜化合物6种基本结构Fig.2 6 kinds of basic structures of G. Lucidum spores triterpenoids

2 灵芝孢子粉有效活性成分

经相关研究表明,直接食用未经破壁处理的灵芝孢子粉,人体对其有效成分的利用率较低,而食用经破壁处理的孢子粉,利用率可达到95%以上,且破壁前后生物活性物质和有效成分含量均有一定的差异[16],因此,建立有效的灵芝孢子破壁方法可以促进对灵芝孢子粉中生物活性成分的提取以及药物价值的研究。芝孢子粉的化学成分复杂,包含三萜类、核苷类、多糖类、维生素类、甾醇类、生物碱、无机微量元素等几大类,其中多糖类、三萜类、核苷类和生物碱类化合物具有不同程度的生物活性和药用价值,也是当前国内外学者研究的热点。

2.1 三萜类

三萜类化合物是灵芝孢子粉的主要活性成分之一,难溶于水,通常具有苦味,根据研究报道已经从灵芝和灵芝孢子油中发现300余种三萜类化合物[17]。三萜类化合物结构较为复杂,分子量为400～600 Da,具有六种基本结构,根据碳骨架上所含官能团种类及支链的不同,可分为灵芝酸类、醛类、醇类、内酯类等[18-19],其多样性的结构,赋予了灵芝孢子粉广泛的生理活性和药理作用。

于华峥等[20]比较了灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中几种化学成分的差异,对其中灵芝三萜的HPLC指纹图谱进行了相似度分析,发现灵芝孢子粉的三萜类化合物集中在孢壁内。谭洪升等[21]采用高氯酸显色法测定和比较了灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中三萜类物质的含量,结果表明破壁灵芝孢子粉中的三萜类化合物的含量高出灵芝子实体中的三萜化合物3倍以上。灵芝孢子油是通过一定手段从破壁灵芝孢子粉中萃取的脂质物质,主要成分有三萜类化合、甾醇和不饱和脂肪酸,杨文婧等[11]研究对比了多种提取法提取破壁灵芝孢子油,通过正交实验优化得到通过超临界CO2萃取灵芝孢子油的最佳条件,在此条件下灵芝孢子油的得率为24.63%,其中三萜类化合物的含量为25.12%。

2.2 多糖类

灵芝多糖是灵芝孢子粉的主要活性成分之一,是灵芝的主要次生代谢产物之一,目前已从灵芝子实体、菌丝体、孢子粉、发酵液中提取分离出多种不同种类的多糖[22-23],因其良好的抗肿瘤活性已成为国内外学者的研究热点。灵芝多糖种类较多,目前己分离到的有200多种,结构复杂,灵芝孢子粉多糖包括以β-(1→6)-D-葡聚糖为主链的多糖、线性(1-3)-α-D-葡聚糖和以β-糖苷键链接的中性杂多糖,其分子量差异性较大,一般都以104Da为数量级,其单糖组成多以葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖7种单糖为主[24],差异性主要体现在其组成比例、糖苷键和肽键结合方式及数量上的不同[25-26]。

黄晓兰等[16]研究了多种提取方法提取灵芝孢子粉多糖,结果表明破壁后的灵芝孢子粉多糖含量是未破壁的1.7倍,单糖组成相同。张芝华等[27]通过高效阴离子色谱法测定了五种不同来源的灵芝孢子粉中的单糖组成,结果表明,不同来源的灵芝孢子粉中单糖组成种类大致相同,以葡萄糖、半乳糖、甘露糖为主,但其比例存在较大差异,总糖在2.05%～4.97%之间。

2.3 核苷类

核苷类成分是灵芝孢子粉中重要的活性成分之一,核苷类化合物包括腺苷、腺嘌呤、虫草素、尿苷、鸟苷、鸟嘌呤等15种,具有明显的药理活性,如抗凝血、镇静中枢神经等作用[28]。王金艳等[29]采用高效液相色谱法对4个产地的灵芝孢子粉中的核苷类成分的种类和含量进行了测定,其研究结果显示尿苷,鸟苷,腺苷三种核苷物质在4个产地的灵芝孢子粉中的含量均较高,由此可以推断其是灵芝孢子粉中的主要核苷成分。除此以外,灵芝孢子粉产地的环境因素[29]、成熟阶段不同的产粉时间[30]对其中核苷类成分的组成和含量具有较为显著的影响。

2.4 无机元素

灵芝孢子粉中含有丰富的无机元素,不同品种灵芝中元素的种类和含量存在一定差异,同生长期的灵芝孢子粉无机元素含量存在明显差异[31]。灵芝孢子粉中含有25种元素,其中Ca、Mg、P、Fe、Zn、Cu、Ni、Co、Cr、Mo、Li、B、V、Sn、Ge、Sr、Ti、Se等19种为人体必需或有益的常量或微量元素,我国人群中比较容易缺乏的主要是Ca、Fe、Zn、Se和I,灵芝孢子粉中Ca、Fe、Zn含量相对较高,食用灵芝孢子粉能够在一定程度上弥补日常膳食中营养元素摄入不足的情况[32-33]。徐靖等[34]通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定和比较了不同破壁方法得到的灵芝孢子粉中的无机元素含量,表明不同破壁方法对无机元素含量的影响较大,灵芝孢子粉中Mn、Fe、Cu、Zn含量较为丰富。胡晓等[35]利用ICP-MS测定了20个产地来源的灵芝孢子粉中的重金属含量,结果显示不同产地灵芝孢子粉之间的重金属含量均无较大差异,并且不同破壁方法不会影响灵芝孢子粉中的重金属含量。

2.5 生物碱

生物碱是一类含有碱性氮原子的杂环化合物,灵芝孢子粉中生物碱类主要有甜菜碱(betaine)及其盐酸盐,胆碱(Choline),烟酸(Nicotinic acid),灵芝碱甲(Ganoine)、灵芝碱乙(Ganodine)等,这些物质在灵芝孢子粉中的含量较低,但其能够起到重要的功效和作用,如胆碱具有良好的促进脑部发育、提高记忆能力、调控信息传递的作用[36]。王亚涛等[37]建立了一种运用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定灵芝子实体和孢子粉中胆碱含量的方法,其结果显示同产地的灵芝孢子粉中胆碱的含量显著高于灵芝子实体。

3 灵芝孢子粉药理活性

灵芝孢子粉有效活性物质含量丰富,不同的活性物质成分具有不同的功能效果,主要为抗氧化、免疫调节、抗癌防癌、保护神经、保肝护肝、调节血脂血糖等。灵芝孢子粉中三萜类物质和多糖类物质含量较高,其药理活性相较于其他活性物质具有更高且多样化的药理活性,是当前研究的热点。

3.1 抗氧化作用

灵芝孢子粉的抗氧化作用较佳,主要与多糖类物质有关,作用效果与多糖的单糖组成、结构和分子量大小有很大的关系。Heleno等[5]考察了灵芝子实体、孢子粉和菌丝体三个部位多糖提取物的抗氧化活性,研究表明,灵芝孢子粉多糖相较于其他两个部位的抗氧化活性最好。刘宇琪等[38]对灵芝孢子粉粗多糖进行了分离提纯,洗脱得到两种灵芝孢子粉多糖,考察了其ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和还原能力,结果表明,灵芝孢子粉纯化多糖具有较高的抗氧化活性。Liu等[39]研究了破壁灵芝孢子粉对肉鸡生长表现、氧化应激和免疫力的影响,结果表明,饲喂破壁灵芝孢子粉的肉鸡的总抗氧化能力、谷胱甘肽还原酶和过氧化氢酶的活性以及肝脏和脾脏中还原型谷胱甘肽的浓度显著高于对照组肉鸡。

3.2 免疫调节作用

免疫调节作用是灵芝孢子粉的一个重要药理作用,在传统中药中已有较长的应用历史,灵芝孢子多糖、三萜化合物和灵芝孢子蛋白质通过不同的作用机制增强机体的特异性免疫和非特异性免疫功能。王瑛等[40]进行了破壁灵芝孢子粉对于增强小鼠免疫功能的实验,其结果显示在细胞免疫功能方面,灵芝孢子粉能够提高Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力,在体液免疫方面可以增加抗体生成细胞数,在单核-巨噬细胞功能方面可以增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力,表明灵芝孢子可以通过增强免疫细胞的活性,从而直接或间接调节机体免疫功能。Habijanic等[41]研究表明灵芝孢子粉通过提高巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的水平来达到调节免疫的作用。

3.3 抗肿瘤作用

灵芝孢子粉的抗肿瘤作用主要由多糖类、三萜类和甾醇类化合物等为主的有效成分起到关键性的作用。灵芝三萜类化合物具有光谱抗肿瘤特性,目前主要体现在对癌细胞的抗转移、抗增殖和抗血管生成活性能力等几个方面,闫征等[4]研究了三种三萜化合物(Ganoderenic acid Y、7-oxo-ganoderic acid Z2和Ganoderon B)与五种肿瘤细胞的量效关系,其研究结果表明Ganoderenic acid Y 的抑制作用较强,癌细胞H460的IC50为22.4 μmol/L,其次是7-oxo-ganoderic acid Z2,其IC50为43.1 μmol/L。彭学翰等[42]研究了灵芝孢子油对人肝癌细胞(HepG2)、人非小细胞型肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)三种细胞株的抗肿瘤活性,经MTT细胞活力实验验证,显示灵芝孢子油对3种肿瘤细胞的生长均具有一定抑制作用,其抑制强度依次为A549细胞、HepG2细胞、HCT116细胞。Zhang等[43]研究了灵芝孢子葡聚糖(GLIS)的免疫活化能力和抗肿瘤作用,其研究发现使用GLIS处理小鼠脾源性肉瘤细胞S180后,小鼠B淋巴细胞能产生大量免疫球蛋白,并促使巨噬细胞分泌大量免疫活性物质如IL-1β和活性氮中间体等,明显提高了巨噬细胞介导的肿瘤细胞毒作用,对肿瘤的生长抑制率达到了60%。除此以外,相关研究还指出灵芝孢子的提取物对肝癌[44]、胆管癌[45-46]、前列腺癌[47]都具有较好的治疗效果。

表1 灵芝孢子粉抗肿瘤作用机制探讨Table 1 Study on anti-tumor mechanism of G. lucidum spores

3.4 保肝作用

有关研究表明,灵芝孢子粉对于肝纤维化、肝损伤、肝炎等常见的几种疾病具有不同程度的作用与效果,保肝、护肝效果明显。Jin等[48]研究了灵芝孢子粉对镉Cd-II 诱导引起的肝毒性损伤的影响和保护机制,证明灵芝孢子对肝损伤小鼠具有保护作用,其主要作用方式是减少血清中ALT、AST含量和MDA含量,改善了组织的病理状态,从而达到保肝作用。胡宗苗等[49]研究了灵芝孢子对CCl4引起的肝纤维化小鼠保护作用,结果显示经灵芝孢子处理的小鼠血清中ALT和AST含量显著降低,肝组织中SOD含量升高,MDA含量降低,同时使得肝纤维化程度降低,抑制了肝组织中MMP-9的蛋白表达,表明灵芝孢子粉对CCl4引起的小鼠肝纤维化损伤有一定保护作用,可能是通过调节MMP-9蛋白表达来实现。

3.5 其他功效作用

灵芝孢子粉具有优良的抗衰老作用,关萍[50]通过构建纤毛虫细胞衰老模型研究了灵芝孢子粉的抗细胞衰老效应,结果显示灵芝孢子粉对细胞增值率、生长周期及RCC-1基因mRNA表达量等多项指标产生的作用效果较显著,加强了模型细胞的生理活性,表现出显著的抗衰老效果。灵芝孢子粉具有抗糖尿作用,姜余梅等[51]通过链脲佐菌素诱导建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,考察了灵芝孢子和抗性淀粉对糖尿病大鼠的血糖、血脂及氧化应激指标的影响,结果显示抗性淀粉和灵芝孢子协同干预可改善糖尿病大鼠血糖水平,对抗糖尿病引起的氧化应激损伤。灵芝孢子粉具有保护神经的作用,Zhou等[52]预先对大鼠进行了不同剂量的饲喂处理,结果显示,服用较高剂量的灵芝孢子粉的大鼠在ICV STZ损伤后,其体内海马区谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧酶(GSH/GR)和丙二醛(MDA)含量能够恢复到常规水平,保护了大鼠的海马区神经细胞,这为预防和治疗阿尔茨海默病提供了良好的依据。Zhu等[53]通过响应面法从灵芝孢子粉中优化提取了一种新的蛋白多糖,并对其药理作用进行了初步的研究,结果表明,蛋白多糖具有较好的降血糖、抗菌和抗肿瘤效果,具有良好的应用潜力。姚金福等[54]研究了灵芝孢子粉对脂多糖(LPS)诱导细胞损伤的保护作用及机制,发现经过给予灵芝孢子粉处理,人气道上皮细胞的活力明显提高,细胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6显著降低,SOD的含量显著提高,同时细胞内NF-κB蛋白表达显著降低,表明灵芝孢子粉对LPS诱导的人气道上皮细胞损伤有保护作用。

4 灵芝孢子粉作用机理

近年来,有关灵芝孢子粉或对其中的功能性成分作用的体外评价和动物实验不断被报道,对其功能性作用机制的研究也逐渐深入,更好地解释相关活性成分的药理作用,也为灵芝孢子粉新药的研发提供重要的指导。灵芝孢子粉的抗肿瘤作用是当前国内外学者的研究热点,对不同肿瘤细胞的作用机制开展了很多的研究,表1归纳整理了灵芝孢子粉的部分抗肿瘤机制研究。

5 灵芝孢子粉开发现状

灵芝及灵芝孢子粉是国内外众多科研院校、研究所和企业单位研究学者的研究热点,促进了灵芝及灵芝孢子粉的应用发展,目前灵芝类的国产药品有178种,灵芝孢子粉类的国产药品仅有4种;灵芝类的保健食品高达1100多种,灵芝孢子类的国产保健食品有400多种(国家市场监督管理总局网站)。在众多的灵芝相关精加工产品中,灵芝保健品种类数量最多[61],由于灵芝孢子粉和灵芝都不属于药食同源的食物,不能作为普通食品添加在食品中,只能够作为药品和保健食品原料进行开发和利用。

5.1 开发应用现状

由于药品的准入门槛较高,研发生产成本较高,目前灵芝孢子粉用于保健品的加工生产是主流。陈祖琴等[62]研究了灵芝保健食品的现状规模,其数据表明单方灵芝保健食品占比超过80%以上,其中以孢子粉为原料的灵芝类保健品占单方灵芝保健食品的40%;复方灵芝保健品主要以灵芝不同原料与其他中药材混合的产品,灵芝原料以灵芝提取物和孢子粉较为常见。用作灵芝类保健品的孢子粉大多通过人工栽培的方式获得,主要原因是由于人工栽培的灵芝相比于野生灵芝生长周期短,得率高,成本低,能够满足工业化生产的需求[63]。此外,破壁灵芝孢子粉的有效活性成分在人体消化环境内被吸收利用的比例高[64-65],故目前灵芝类保健品多以破壁灵芝孢子粉为原料,近年来随着栽培技术、采集技术的发展以及种植规模的扩大,孢子粉的产量不断增加,灵芝孢子粉在保健品中的应用已经超过了灵芝子实体[20]。

5.2 功能作用现状

目前已备案的灵芝孢子保健品的保健功能有11种,分别为增强免疫力、保肝护肝、缓解疲劳、改善睡眠、降血糖、降血脂、抗辐射、增强缺氧耐受能力、抗氧化、减肥、改善记忆,多数保健品为单一保健功能,以增强免疫力这一保健功能占大部分,其主要原因在于一方面灵芝孢子粉具有增强免疫力这一药理活性已被大量研究报道[6,66-67],另一方面灵芝孢子保健品申报增强免疫力这一保健功能无需进行人体实验,相对成本较低、周期短。

5.3 其他功能与应用

目前对于灵芝孢子粉的研究也出现了一些非生物学和药理学的研究,为灵芝孢子粉的多元化利用提供了新的思路。Zhou等[68]研究了一种通过喷雾干燥微胶囊保护灵芝孢子油的方法,选用阿拉伯胶和麦芽糖糊精作为壁材是一种最佳的组合,可显著提高灵芝孢子油的氧化稳定性。Zhu等[69]通过双频超声辐射技术成功将灵芝孢子粉的几丁质转化为壳多糖,其制备的样品对L929细胞的增殖具有一定的影响,同时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用。Fan等[70]利用灵芝孢子粉制取了一种新型磁性孢子微球,作为固定CotA多铜氧化酶的支撑材料,对其负载能力展开了研究,结果显示装载有CotA的磁性微球可以通过外部磁场容易且快速地回收,活性高,且连续10次循环后保持75%的活性,表明磁性孢子微球是用于固定酶的良好支撑材料。

6 结论与展望

灵芝孢子粉及其相关产品因其优良的生物学活性及其广泛的药理作用越来越受到消费者的青睐。近年来,国内外学者已对灵芝孢子粉进行了广泛的药理作用和保健功能的研究,对部分活性成分进行了提取分离、纯化和结构鉴定,不断有新的药理活性被报道,在新药开发、治疗佐剂、保健食品等方面展现出巨大的开发前景。但受到灵芝孢子粉内活性成分组成的复杂性和分离分析方法的制约,相关活性成分的分子结构、作用途径、细胞水平和分子水平的作用机制的明确报道很少,临床研究也相对缺乏,这将成为今后研究工作的重点。此外,当前对于去壁灵芝孢子粉副产物(主要成分为灵芝孢子壁)已见一些研究报道,合理利用去壁灵芝孢子粉副产物对于提高综合经济效益及减少废弃物的生成进而降低废渣处理成本和对环境的污染具有重要的研究意义。

随着灵芝种植规模的扩大,栽培技术和灵芝孢子收集技术的发展,破壁方法及分离技术的进步,对灵芝孢子粉的研究将会不断深入,灵芝孢子粉更多的药理作用将会不断被发掘和证实,有望开发出新型药品和新型保健品,为消费者提供更多且更有针对性的选择,推动灵芝孢子粉精深加工产品国际化进程。