鲽鱼骨胶原蛋白的结构及流变学特性

蔡路昀 史 航 曹爱玲 周小敏 张宇昊 赵元晖 励建荣*

（1 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心渤海大学食品科学与工程学院 辽宁锦州121013 2 杭州海关 杭州311208 3 浙江兴业集团有限公司 浙江舟山316101 4 西南大学食品学院 重庆400715 5 中国海洋大学食品科学与工程学院 山东青岛266100）

胶原蛋白（collagen）在动物体内含量多、分布广，约占哺乳动物总蛋白的25%～30%，构成了全身大部分的结缔组织，肌腱、眼球、血管、骨骼也含有大量的胶原蛋白。胶原蛋白具有低免疫原性、相容性、可降解性、凝血性等生物特性，其优良的性质已被应用到生物医学材料、组织工程、烧伤、美容、食品等领域并占有重要地位。目前已发现28种胶原蛋白，最为常见的是纤维状的Ⅰ型胶原蛋白[1]。研究发现，水产动物体内胶原蛋白含量高于陆生动物，且种类较少，主要由分布在鳞、鳔、肌肉、皮、骨等处的Ⅰ型、脊索和软骨的Ⅱ型、Ⅺ型以及肌肉的V 型组成，其中Ⅰ型胶原蛋白富含丙氨酸和糖结合型的羟赖氨酸[2]。

鲽鱼（Pleuronichthys coconuts）又称比目鱼，是温带海域重要的经济鱼类。鲽鱼含有丰富的多不饱和脂肪酸，易被人体吸收，有助于降低血液中胆固醇浓度[3]。目前国内外对鲽鱼的研究主要侧重于养殖育种方面。随着养殖技术的提高，鲽鱼产量稳步上升。然而目前我国海水鱼加工科技含量低，加工过程中会产生大量的下脚料如鱼皮、鱼骨等，尤其是鲽鱼鱼骨，其质量约占整鱼的40%，这些下脚料常常被丢弃或以低价卖给鱼粉厂，简单做成鱼粉和肥料等低附加值产品，资源和副产物的利用程度低，造成巨大的经济损失，严重制约着海水渔业的可持续发展。

本文以鲽鱼加工副产物鱼骨为材料，采用酸法和酶法对鲽鱼骨胶原蛋白进行提取纯化，对其结构性质与流变学特性进行分析，以期为鲽鱼骨胶原蛋白的开发利用及工业化应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲽鱼鱼骨，由大连天宝绿色食品股份有限公司提供；胃蛋白酶（50 万U/g），吉宝（青岛）生物科技有限公司；丙烯酰胺 （Acr）、四甲基乙二胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考马斯亮蓝R-250（优级纯）、标准蛋白（分子质量6.5～200 ku），上海索莱宝公司；NaOH、异丙醇、冰乙酸、KBr、NaCl、EDTA-2Na，锦州国药器化玻有限公司。

1.2 仪器与设备

Biofuge stratos 台式高速冷冻离心机，美国Thermo 公司；DHR-1 流变仪，美国TA 公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司；Free Zone 2.5 真空冷冻干燥机，美国Labconco 公司；UV-2550 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；Scimitar2000 傅里叶变换红外光谱仪，美国Agilent 公司；S-4800场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore 公司；Mini Protean 3凝胶电泳仪，美国Bio-Rad 公司；ZD-9556 脱色摇床，常州市凯航仪器有限公司；GS-800 拍照系统，美国Bio-Rad 公司；HTC-100 恒温恒湿培养箱，上海三腾仪器有限公司；DHR-1 流变仪，美国TA 公司；SZ-1 快速混匀器，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；DSC-Q2000 差示扫描量热仪，美国TA 公司。

1.3 鲽鱼鱼骨预处理

首先将鱼骨用去离子水清洗剔除干净后放入4 ℃冰箱备用。以下提取纯化操作均在4 ℃下进行。参考Somasundaram 等[4]方法稍作修改，称取一定质量鱼骨并将其均匀剪切至2～3 mm，加入其质量20 倍的0.1 mol/L NaOH 溶液以去除杂蛋白，低速搅拌浸泡，每2 h 换一次溶液，6 h 后加入其质量30 倍的10%异丙醇溶液以去除脂肪，每12 h 换一次溶液浸泡一天，再加入其质量5 倍的0.5 mol/L EDTA-2Na 溶液，每12 h 换一次溶液，更换5 次。鱼骨每换一种溶液均用去离子水反复冲洗至中性，充分沥干。将鱼骨冷冻干燥后密封放入-20 ℃冰箱待用。

1.4 酸法提取

参考Zhang 等[5]方法稍作修改，称取预处理后的鱼骨，加入其质量20 倍的0.5 mol/L 冰乙酸溶液，在4 ℃下低速搅拌12 h 后以10 000 r/min 离心20 min，收集上清液放于4 ℃冰箱。之后将未提取彻底的鱼骨进行以上相同处理，如此反复3 次，合并混合上清液得酸法胶原蛋白粗提液。

1.5 酶法提取

参考Chen 等[6]方法稍作修改，称取预处理后的鱼骨加入其质量10 倍的超纯水，用0.5 mol/L的冰乙酸将溶液的pH 调至1.9 左右，加入原鱼骨质量2%的胃蛋白酶，后续方法同酸法处理，如此反复两次，合并收集上清液得酶法胶原蛋白粗提液。

1.6 胶原蛋白粗提液的纯化

参考Somasundaram 等[4]方法稍作修改，酶法胶原蛋白粗提液先用高浓度NaOH 溶液将pH 调至8.0 以上进行灭酶，然后均匀慢速加入NaCl 固体粉末至其浓度达到0.9 mol/L，使粉末充分溶解并保证无大块固体沉积。酸法胶原蛋白粗提液的处理同上，但无需调pH。将以上处理好的溶液放置4 ℃冰箱过夜后，以12 000 r/min 在4 ℃下离心30 min 得盐析沉淀。分别将两种沉淀复溶于0.5 mol/L 冰乙酸中，依次用0.1 mol/L 冰乙酸、超纯水进行透析直至溶液中无氯离子检出，最后将透析过后的溶液进行冷冻干燥即得到样品酸溶性胶原蛋白（ASC）和酶溶性胶原蛋白（PSC）。

1.7 鲽鱼骨胶原蛋白的结构分析

1.7.1 紫外光谱分析 参考Caputo 等[7]方法稍作修改，准确称取2 mg 冻干的胶原蛋白样品，充分溶解于10 mL 的0.5 mol/L 冰乙酸溶液中，以0.5 mol/L 冰乙酸作空白对照，常温下用紫外可见分光光度计在190～400 nm 波长范围内中速扫描，波长间隔2 nm。

1.7.2 红外光谱扫描分析 参考Jeong 等[8]方法稍作修改，通过傅里叶红外光谱仪对胶原蛋白二级结构的组成进行分析。分别取冻干的胶原蛋白样品（1 mg）与干燥的KBr（100 mg）置于玛瑙研钵中研磨成均匀粉末，装样压片，放入样品室扫描。波数范围4 000～500 cm-1，分辨率为2 cm-1。

1.7.3 SDS-PAGE 分析 参考Lowry 等[9]方法并稍作修改，分别取2 mg ASC 或PSC 冻干样品溶于10% SDS 中，加热至85 ℃保持1 h 后，按1 ∶1的比例与上样缓冲液混合后，沸水浴3～5 min，冷却后取10 μL 上样。采用5%的浓缩胶，12%的分离胶制胶。采用直压恒流电源，浓缩胶80 V，分离胶120 V，结束后，用考马斯亮蓝R-250 染色40 min，脱色后观察分析。

1.7.4 DSC 分析 参考温慧芳等[10]方法稍作修改，利用差式扫描量热仪测量鲽鱼骨胶原蛋白的热收缩温度。称取7 mg 冻干样品于DSC 坩埚中，加盖压片密封后，以空坩埚作对照，在20 ℃保持1 min，从20 ℃加热至80 ℃，升温速度为5 ℃/min。

1.7.5 SEM 扫描分析 参考Palka 等[11]方法稍作修改，利用扫描电镜观察鲽鱼骨胶原蛋白的微观结构。取适量冻干的形状规则的胶原蛋白样品经离子溅射镀金，在3.0 kV 电压下放大1 000 倍观察胶原蛋白的表面结构。

1.8 流变学分析

取适量冻干的胶原蛋白样品溶解于0.5 mol/L的冰乙酸中并充分混合均匀，配制成质量分数为1%的胶原蛋白溶液。使用40 mm、2°的椎板，在20℃条件下进行测试。在振荡模式下，采用频率扫描的数据获取模式，频率扫描范围为0.1～10 Hz，变量扫描为对数模式，采集33 个变量点，控制变量为形变率（30%）。研究胶原蛋白溶液的储能模量（弹性模量）G′、损耗模量（黏性模量）G″随着振荡频率变化的规律[12]。

2 结果与分析

2.1 紫外光谱的分析

图1 鲽鱼骨ASC 和PSC 的紫外吸收光谱图Fig.1 UV spectrum of ASC and PSC from flounder bone

胶原蛋白分子结构的肽链和侧链是产生紫外吸收的主要原因。如图1所示，在210 nm 波长以下产生的吸收峰是由于胶原蛋白分子中存在的肽键及相关构象[13]；在226 nm 和227 nm 处分别产生鲽鱼骨PSC 和ASC 的最大吸收峰，是由于肽键C=O 的n→π* 跃迁所致，符合Ⅰ型胶原蛋白三股螺旋结构的紫外吸收特征[14]；而Ⅰ型胶原蛋白的一级结构中缺乏如酪氨酸、苯丙氨酸等具有共轭双键的芳香族氨基酸，因此没有出现大多数蛋白质在280 nm 处的吸收峰[15]。而这与其它鱼胶原蛋白的研究结果相似[16]。由胶原蛋白的紫外光谱扫描可以看出ASC 与PSC 具有相似的吸收峰，故此推断鲽鱼骨ASC 与PSC 具有一定相似程度的一级结构。

2.2 红外光谱分析

如图2和表1所示ASC 和PSC 均具有胶原蛋白红外光谱特征吸收峰，包括酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及A 和B 带。ASC 和PSC 的酰胺A 带的吸收峰波长均小于3 400 cm-1，是吸收峰由于NH 基团与氢键缔合后发生了蓝移现象[17]。酰胺B 带是由于-CH2-产生的不对称伸缩振动。

酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带是反映蛋白质肽链骨架结构最重要的吸收峰，与胶原蛋白分子结构有关[18]。酰胺Ⅰ带为蛋白质二级结构变化的敏锐区域，酰胺Ⅱ带为α-螺旋、β-折叠、转角和无规卷曲的扭转振动峰；酰胺Ⅰ和Ⅱ反映了肽链之间的交联程度，肽链结合越紧密振动频率越大，由图2显示PSC 的3 条α 肽链比ASC 结合紧密[19]。酰胺Ⅲ带反应了胶原蛋白是否保持了完整的三螺旋结构，是甘氨酸和脯氨酸残基的-CH2-特征振动峰[20]，由此可以说明ASC 和PSC 均具有完整的三螺旋结构。

2.3 SDS-PAGE 分析

由图3电泳图谱可以看出，胶原蛋白的相对分子质量大，1 个胶原分子相对分子质量为300 ku，即胶原的每条多肽链相对分子质量可达100 ku[21]。在高于200 ku 处ASC 出现的可能是Ⅰ型胶原蛋白α 链的三聚体γ 链，在200 ku 附近均出现的1 条泳带是β 链，在100 ku 附近ASC 与PSC 分别出现的2 条泳带分别是α1 链和α2 链，表明ASC 与PSC 主要含有Ⅰ型胶原蛋白，并且具有较完整的三螺旋结构[22]。相对于PSC 来说ASC 在66.4 ku 以下的部分出现较浅甚至难以分辨的条带，是因为PSC 在提取过程中胃蛋白酶使其分解成其它小分子，由此也可以看出ASC 比PSC 相对更纯、更完整。

表1 鲽鱼骨ASC 和PSC 红外光谱出峰位置及图谱解析Table 1 Peak position and analysis of ASC and PSC from flounder bone

图2 鲽鱼骨ASC 和PSC 的红外吸收光谱图Fig.2 The infrared spectra of ASC and PSC from flounder bone

2.4 DSC 分析

差示扫描量热法 （differential scanning calorimetry，DSC）对于胶原蛋白来说，是一种分辨率高、试样用量少的热分析方法。三螺旋和形成胶原分子周围的水合网络的氢键之间的断裂是胶原蛋白产生高焓的原因[23]，DSC 图谱反映ASC 的热焊值为7.314 J/g，高于PSC 的热焊值2.429 J/g，说明ACS 具有的交联键比PSC 的多。聚合物热稳定性是由变性温度（Td）这一重要指标反映出来的，而Td 是胶原蛋白三螺旋分解成无规则结构的温度值[24]，Td 从伸展和三螺旋结构有序卷曲到随机结构的转变伴随着分子质量的损失和物理化学性质的改变。可以通过图4直观地看出鲽鱼骨胶原蛋白的峰值温度分别是ASC 为52.24 ℃，PSC 为49.65 ℃。由于胶原蛋白的热稳定性主要与脯氨酸和羟脯氨酸的吡咯烷环相连，部分与羟脯氨酸羟基的氢键结合[25]。胃蛋白酶对端肽的去除可能不利于通过氢键稳定三螺旋结构，从而导致鲽鱼骨PSC 的Td 降低。一般情况下，生活在寒冷地区鲽鱼的胶原蛋白羟脯氨酸浓度较低，导致热稳定性低于生活在温暖栖息地的鲽鱼[26]。

图3 鲽鱼骨胶原蛋白SDS-PAGE 电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis pattern of collagen from flounder bone

2.5 SEM 分析

图4 鲽鱼骨ASC 与PSC 的DSC 图谱Fig.4 DSC thermogram of ASC and PSC from flounder bone

冻干后的鲽鱼骨ASC 与PSC 样品呈现柔软白色海绵状，肉眼可观察到疏松多丝状，且ASC颜色呈现纯白无杂质，PSC 则呈现白色微黄。通过在电镜放大1 000 倍扫描，如图5（a，b）显示出纤维状的网状结构。ASC 相对PSC 较光滑，结构较均匀，PSC 比ASC 多孔且孔径较多分布不均匀，这是由于冻干前两种胶原浓度不同所致[27]。以上特征与Zhang 等[28]研究一致。说明胃蛋白酶对胶原蛋白有结构上的改变，但整体还是网状结构，酸法提取出的胶原蛋白较好地保持了自身结构。两种胶原蛋白均比较适合作为药物载体，能够很好地应用到食品、化妆品等领域[29]。

2.6 DHR 分析

图5 鲽鱼骨PSC（a）与ASC（b）扫描电镜图Fig.5 Scanning electron micrographs of PSC （a）and ASC （b）from flounder bone

图6 鲽鱼骨ASC 和PSC 胶原蛋白溶液的流变学曲线Fig.6 Rheological characteristics of collagen solutions of ASC and PSC from flounder bone

鲽鱼骨胶原蛋白溶液可通过振荡模型测定其粘弹性，即对胶原蛋白分子施加一个扭摆力矩，使其在此力矩下发生运动[30]。根据扭摆力矩频率从低到高的变化，分子链的运动发生相应的改变并测定粘弹性[31]。G′表示胶原蛋白分子随外力的改变发生形变的能力，G″表示胶原蛋白分子在外力作用发生改变，分子链内部或分子间拉伸导致的能量损耗[32]。如图6所示，振荡频率在0.1～4 Hz时，随着振荡频率的升高，ASC 与PSC 的储能模量升高且相差不多；在4～10 Hz 振荡频率时，PSC 储能模量增量显著高于ASC。如图7所示，振荡频率在0.1～5.5 Hz 时，两种胶原蛋白分子损耗模量随振荡频率升高而升高且相差不多；在5.5～10 Hz时，PSC 的损耗模量增量微高于ASC。说明ASC与PSC 的流变学特性不同，且随着振荡频率的增大，ASC 与PSC 溶液主要表现出弹性特征。PSC 的G′和G″斜率均大于ASC，说明在0.1～10 Hz 的频率下具有较高的凝胶稳定性[33]。

3 结论

本文用鲽鱼骨以酸法与酶法提取制备胶原蛋白并研究了其结构及流变学特性。结果表明：鲽鱼骨ASC 与PSC 在紫外吸收上均在227nm 附近出现最大吸收峰，是典型的Ⅰ型胶原蛋白；红外光谱与SDS-PAGE 电泳均显示ASC 与PSC 具有较为完整的三螺旋结构，是Ⅰ型胶原蛋白；通过DSC测出ASC 与PSC 的热变性温度分别为52.24 ℃与49.65 ℃，可能是由于两种方法提取的两种胶原蛋白存在构型差异；通过电镜扫描显示ASC 与PSC 都呈现交织状纤维网状结构，ASC 分布相对更均匀，可作为很好的医用材料；流变学特性显示在0.1～10 Hz 的振荡频率下，ASC 与PSC 的储能模量与损耗模量都随着频率的升高而增大，两者的溶液主要表现为弹性特征，但PSC 的储能模量和损耗模量的斜率均大于ASC，因而具有较高的凝胶稳定性。综上，ASC 与PSC 因提取方法不同而存在一些差异，但均适用于食品、保健品、化妆品和药品等行业，可根据实际要求对其进行应用，本研究可为鲽鱼加工主要副产物鱼骨的综合利用和开发提供一定的数据支持和理论基础。