溶剂和微乳化的稀释效应对食用植物精油抗菌活性的影响

崔绮嫦 吴克刚 莫镕弛 段雪娟

（1 广东工业大学轻工化工学院 广州510006 2 佛山中纺联检验技术服务有限公司 广东佛山528211 3 广州市香思馨情健康科技有限公司 广州510006 4 广州市蓝海人才服务有限公司 广州510030）

许多食用香辛料的精油具有良好的抗菌活性、高安全性、低毒副性等优点，可用来开发为天然防腐剂。然而，一些存在于食品体系中的因素，如水分活度、脂肪含量、蛋白质、pH 和酶类会对植物精油的抗菌活性造成影响[1-2]。当植物精油作为防腐剂添加到食品体系中时，所需植物精油的浓度要比体外抑菌试验的高出1%～3%，超出感官可接受范围[3]。产生这种现象的原因，可能是因为食品体系中富含的脂肪或蛋白质对被损坏的菌体具有修复作用，从而降低了植物精油的抑菌效果。其次，食品中水分活度较高时，会降低植物精油的溶解性能和稳定性，使其抗菌效果减弱。另外，一些外界因素，如包装类型和环境温度也会影响微生物对植物精油的敏感度[1-2]。采用包埋技术为植物精油提供运输载体十分必要。许多包埋技术，如微乳液、微胶囊、溶剂等载体可改善植物精油的挥发性和水溶性，降低外界环境对其抗菌活性的影响，减少对食品质构与感官的影响。有研究表明微乳化可有效提高植物精油的抗菌活性，有效延长抗菌作用的时间[4-5]。本文通过溶剂、乳化两种稀释载体“加工”植物精油复合物（牛至∶百里香=1 ∶1[6]），以提高其水相溶解性能，对其质量及稳定性进行评价，探究稀释载体对植物精油抗菌活性的影响，以扩大食用植物精油作为防腐保鲜剂在食品工业中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）ATCC 6633、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）ATCC 25923、酿酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）GIM 2.207、黄曲霉 （Aspergillus flavus）ATCC 9643、黑曲霉 （Aspergillus niger）ATCC 16404、桔青霉（Penicillium citrinum）ATCC 9849，购自广东省微生物研究所。

食用复合植物精油（主要成分为牛至精油、百里香精油）、香芹酚（95%）、百里香酚均为食用级，由广东香飘三创（产学研）众创平台提供。

营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、营养肉汤、霉菌液体培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；无水乙醇，1，2-丙二醇、丙三醇、Tween80 均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 溶剂对食用植物精油抗菌活性的影响

1.2.1.1 菌种活化和菌悬液/孢子悬液的制备 参照吴克刚等[6]的方法。

1.2.1.2 植物精油溶解性能的测定 无水乙醇、1，2-丙二醇、丙三醇各2 mL，分别加入等量的植物精油复合物（牛至∶百里香=1 ∶1），振荡混合，室温静置24 h，观察是否混浊。

1.2.1.3 溶剂对植物精油抗菌活性的影响 参照吴克刚等[6]的方法测定最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。无水乙醇、1，2-丙二醇、丙三醇作溶剂，稀释制得10%植物精油复合物（牛至∶百里香=1 ∶1），在5 mL 肉汤中加入100 μL 菌悬液，添加适量的10%植物精油复合物使其在肉汤中质量浓度为31.25～500 μL/L，等量的溶剂作对照，置恒温振荡器中培养，观察肉汤浑浊情况。

1.2.2 微乳体系的质量评价及其对植物精油抗菌活性的影响

1.2.2.1 滴定法构建植物精油微乳液拟三元相图[7-8]植物精油复合物（牛至∶百里香=1∶1）为油相（O）、Tween80 为表面活性剂、无水乙醇为助表面活性剂，按照表面活性剂与助表面活性剂的配比（Km=2 ∶1，3 ∶1），准确称取一定量的Tween80 和无水乙醇于存储瓶中，40 ℃恒温搅拌30 min 制备不同Km值下的混合表面活性剂（Smix）；根据混合表面活性剂（Smix）与油相（O）的质量比9∶1～1∶9，准确称取一定量的混合表面活性剂和植物精油复合物置于存储瓶，40 ℃恒温搅拌后边滴加同等温度的去离子水（W）边搅拌，肉眼观察，如形成流动性好、半透明且呈淡蓝色乳光的溶液时即为微乳。记录临界点时去离子水（W）的添加量，计算各组分在该临界点时的质量分数；Origin8.5 绘制微乳液的拟三元相图，AutoCAD 软件计算各微乳区域的面积，以确定制备微乳液的最佳Km值。

1.2.2.2 植物精油微乳液的质量评价

1）微乳液构型的鉴定 参照王浩[8]的方法，利用电导率仪测定微乳液经水稀释过程中的电导率变化。

2）微乳液的外观、溶液颜色与澄清度检测根据《中国药典》（2010年版）[9]II 部附录IXA 溶液颜色检查法与IXB 澄清度检查法对微乳液的颜色和澄清度进行检查。

3）比重瓶法测定密度 根据GBT 5009.2-2003 食品的相对密度的测定[10]对微乳液的密度进行检查。

4）微乳液理化参数的测定 采用美国Brookhaven 公司Zeta 电位及粒度分析仪对所选微乳液配方的粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI）及Zeta 电位（zeta potential，ZP）进行分析；雷磁PHS-3C 型pH 计测定微乳液的pH 值；NDJ-1 旋转黏度计测定微乳液的黏度。

5）微乳液中香芹酚及百里香酚含量的检测采用紫外分光光度法对微乳液中的香芹酚及百里香酚含量进行测定。

1.2.2.3 植物精油微乳液的稳定性评价与抗菌活性检测

1）盐/甜味剂对微乳液稳定性的影响 取适量微乳液于试管中，添加一定量的NaCl/蔗糖/果葡糖浆使其质量分数为1%～5%，混合后经4 000 r/min 离心20 min 观察体系是否分层。

2）pH 对微乳液稳定性的影响 选 择0.1 mol/L 柠檬酸溶液与0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液调节微乳液的pH 值为3～8，室温静置30 min后离心观察体系是否分层。

3）微乳液的贮藏稳定性 将微乳液样品置于28 ℃下储存，每月取样测定其粒径变化，离心观察体系是否分层；将微乳液样品置于4 ℃下储藏，每隔10 d 取样测定其粒径变化，离心观察体系是否分层。

4）植物精油微乳液抗菌活性的检测 参考1.2.1.3节。

1.2.3 数据处理与分析 每个试验重复3 次，试验结果表示为：平均值±标准偏差；采用SPSS 18.0数据统计分析软件进行单因素方差分析（F检验）。

2 结果与讨论

2.1 植物精油的溶解性能

分别探究植物精油复合物在不同溶剂中的溶解情况，结果见表1。植物精油在无水乙醇中可以完全溶解，而在1，2-丙二醇及丙三醇中只能部分溶解或不溶解，这现象与溶剂自身性质有关。化学结构中含羟基数越多，其亲水性和极性越强，而植物精油的主要成分是萜烯类化合物（（C5H8）n），不溶或微溶于水，具有亲脂性。无水乙醇含有一个羟基，具有良好的亲水性，极性弱；而1，2-丙二醇和丙三醇分别含有2 个和3 个羟基，具有较强的亲水性，极性强。

表1 牛至-百里香复合物在溶剂中的溶解情况Table 1 Dissolution of the thyme-oregano compound in different solvents

2.2 溶剂对植物精油水相抗菌活性的影响

为了解溶剂对植物精油复合物抗菌效果的影响，通过测定其对食品常见腐败微生物的MIC 和MBC 进行研究，结果见表2。

表2 溶剂对牛至-百里香复合物抗菌活性的影响（μL/L）Table 2 Effect of solvent on the antibacterial activity of the thyme-oregano compound （μL/L）

根据表2的色块深浅，从综合抗菌效果来看，1，2-丙二醇作溶剂时能有效提高植物精油复合物的抗菌效果，MIC 值和MBC 值均为最低。一种物质的液相抗菌效果取决于其自身的抗菌活性、挥发性及水溶性。无水乙醇易溶于水、易挥发，自身具有一定抗菌性，但其促挥发性会降低植物精油的溶解度，从而影响抗菌效果。1，2-丙二醇和丙三醇均易溶于水、不挥发、自身无抗菌性，但1，2-丙二醇更易溶解植物精油，且其不挥发性也抑制了精油的挥发性，促进精油的水溶性，从而提高精油抗菌效果。

2.3 植物精油微乳液体系的优化

2.3.1 表面活性剂与助表面活性剂配比 （Km值）对相图的影响 在微乳液拟三元相图中，微乳区域面积反映了油相的增溶量，最小可稀释比（DR）反映了制备可稀释型微乳液时表面活性剂的最小用量[7]。从图1可知，以微乳区域面积为指标，当Km=3∶1 时，所形成的微乳区面积（29.55%）比Km=2∶1 时的微乳区面积（27.13%）略大一些，最小可稀释比（DR 值）为9∶1，其对应的表面活性剂和植物精油间质量比（S/O）为6.76 ∶1。Trotta 等[11]认为微乳液区域面积大小与Km值密切相关。王浩[8]的研究也发现Km值较低时，相对浓度较高的助表面活性剂会减弱表面活性剂与水相的结合能力，微乳区域面积相对减少；而Km值较高时，相对浓度较高的表面活性剂因缺乏助表面活性剂的助乳化作用而导致自乳化能力下降，微乳区域面积也相对减少。

图1 不同Km 值下微乳液的拟三元相图Fig.1 Pseudoternary phase diagram of microemulsions with different Km

2.3.2 电导率法鉴定微乳液构型 根据Fang 等[8]的渗透理论，见图2，当水分含量低于56%时为W/O 型微乳液；当水分含量高于66%～68%时为O/W 型微乳液；当水分含量介于两者间时为B.C.型微乳液。试验结果与王浩[8]的报道相近。

2.3.3 确定微乳液的配方 Km值为3 时，所形成的微乳液区域面积最大，该比例更适合制备可稀释型植物精油微乳液。选择图1（b）微乳区内、区外、稀释线T91 上3 个点对应的配方进行后续研究，各配方其组分的质量分数见图3。

图2 不同Km 值的微乳液电导率图（（Tween80+乙醇）∶精油=9∶1）Fig.2 Variation of electrical conductivity with water content for microemulsions with different Km

图3 不同微乳液配方的组成Fig.3 Composition of different formulations on microemulsion

2.4 植物精油微乳液的质量评价

2.4.1 微乳液的外观、溶液颜色与澄清度 所制的植物精油微乳液在自然光下为淡黄、透明均一液体，去离子水稀释100 倍后呈淡蓝色乳光，见图4，符合《中国药典》对颜色和澄清度的标准。

图4 植物精油微乳液的外观Fig.4 Performance of the mixed essential oils microemulsion

2.4.2 微乳液的理化参数 不同配方微乳的密度与水接近（表3），黏度适中，体系为偏酸性，符合杀菌剂的质量要求。Shakeel F 等[13-14]的研究指出微乳液的Zeta 电位绝对值为30 mV 时表现出良好稳定性。配方F3 的Zeta 电位最低（-22.23 mV±0.24 mV），数值接近30 mV，说明其具有良好稳定性；且其粒 径（13.0 nm ± 0.6 nm）和PDI 值（0.231 ± 0.020）均为最小，表明该配方的粒径分布更集中，粒径大小均一。

表3 植物精油微乳液的理化参数Table 3 The physicochemical parameters of the mixed essential oils microemulsion

2.4.3 微乳液的理化参数 对标准品、精油进行全波长扫描（图5），发现均在276 nm 处有一个明显的吸收峰，而无水乙醇和微乳液其它成分在此处吸收甚少，与文献报道的相近[15]。以浓度（x）为横坐标，吸光度A（y）为纵坐标绘制标准吸收曲线，经回归后，百里香酚的标准曲线方程为y=0.0178x+0.002，R2=0.9993；香芹酚的标准曲线方程为y=0.0149x+0.0104，R2=0.9991，表明标准曲线方程在10.5～94.5 μg/mL 质量浓度范围内具有良好线性关系（图6）。

植物精油微乳液稀释1 000 倍后，在276 nm波长处测定其吸光度（表4）。F1、F2、F3 配方含植物精油的质量分数分别为3.57%，2.55%，2.57%，以百里香酚浓度反映3 个配方微乳液中所含植物精油的量，发现配方F1 含百里香酚量最多（19.48 mg/mL），配方F3 次之，这与制备微乳液时所添加植物精油的量对应，说明以Tween80 为表面活性剂制备微乳液，能较好地保留其主要化学成分，减弱氧化挥发性，提高植物精油水溶性。

2.5 植物精油微乳液的稳定性、抗菌活性评价

2.5.1 介质环境的影响 一般食品体系在实际应用中都加有一定量的电解质与一些食品添加剂，因此改变体系的介质环境，探究其对微乳液稳定性的影响，结果见图7。

图5 各标准品的紫外吸收曲线图Fig.5 UV absorption curve of the standard products

图6 百里香酚和香芹酚的紫外标准曲线图Fig.6 UV standard curves figure of thymol and carvacrol

表4 不同植物精油微乳液配方的吸光度Table 4 Absorbance of different formula of the mixed essential oils microemulsion

图7 介质环境对植物精油微乳液稳定性的影响Fig.7 Effect of medium environment on the stability of the mixed essential oils microemulsion

微乳液体系中加入适量无机电解质，经静置其仍能保持半透明/透明状态，说明该微乳液具有一定的抗盐能力。这是因为无机电解质对非离子型表面活性剂的疏水基具有“盐析”作用[16]。电解质的加入会破坏水相中的氢键，降低Tween80 的“浊度”和临界胶束浓度，增加胶团聚集数，利于缔结形成大胶团，达到一定程度便会出现浑浊分层现象。此外，界面膜的耗损也能引起“盐析”作用[17]。

改变微乳液体系pH 值，经静置其仍保持透明状态，说明该微乳液具有良好抗酸碱性。因为非离子型表面活性剂所形成乳液的膜结构主要是靠氧乙烯链组成，其膜性质变化取决于氧乙烯基团上的氧与其它化合物间的缔合作用[18]，受H+浓度的影响较小。

2.5.2 贮藏稳定性 粒径是表征微乳液稳定性的一个重要指标。从图8可知，配方F3 在试验温度与时间范围内其粒径变化均较为平缓，离心后未出现相分离现象，说明该配方在短时低温冷藏及长时常温贮藏下均具有良好的稳定性，这可能与该配方具有较低的PDI 值和适宜的Zeta 电位密切相关。配方F2 对应的点位于微乳区的有效稀释线T91 上，能被水无限性稀释，因此其粒径随着贮藏时间的延长变化也甚微。

图8 不同贮藏温度下植物精油微乳液的粒径变化Fig.8 The change of particle diameter of the mixed essential oils microemulsion under different storage temperature

2.5.3 植物精油微乳液的抗菌活性研究 结合食品工业安全应用，本试验选择了配方F2 进行抗菌试验，以了解微乳液对植物精油复合物的抗菌效果，结果见表5。由Tween80 形成的植物精油微乳液其MIC 值在香辛料应用于食品中最大允许添加量0.2%范围内未表现出抗菌活性，该试验现象与一些研究者[8，19-20]的报道相似，这可能是因为微乳液包埋体系对植物精油的抗菌效果产生了负面影响。

表5 微乳液对植物精油复合物MIC 值的影响（μL/L）Table 5 Effect of the microemulsion on minimum inhibitory concentration （MIC）value of the mixed essential oils compound （μL/L）

对于O/W 型微乳液体系，水为连续相，将植物精油包埋在疏水性胶束核内，植物精油需从胶束内释放并穿过水相后才能作用于菌体细胞壁[21]。而SYLVIA GAYSINSKY 等[22]认为微乳液抗菌效果的差异性主要是因为胶束粒径大小、胶束的结构及胶束与植物精油成分间的相互作用。根据植物精油可溶性成分与表面活性剂的极性头和非极性尾的相互作用，植物精油抗菌成分（游离的羟基基团）可位于胶束内部或胶束表面附近[22]，因此，该基团在纳米胶束表面的可利用性对其抗菌性能具有十分重要的作用。Donsi 等[23]却认为乳液的抗菌性能与液滴粒径大小无关，与被乳化的抗菌成分水相平衡浓度有关。Ferreira J.P 等[20]认为表面活性剂、助表面活性剂的种类也与微乳液抗菌效果的差异性有关，如油酸乙酯、磷酸三丁酯等[20]作为微乳体系组成成分，均具有一定抗菌性，对微乳液整体抗菌效果具有协同增效作用。

3 结论

植物精油复合物（牛至∶百里香=1 ∶1）具有良好抗菌活性，但存在易挥发、水溶性差、异味大等缺点，本研究通过构建食品级稀释体系，解决了植物精油复合物（牛至∶百里香=1 ∶1）的易挥发、水溶性差问题，且具备良好的耐酸、耐碱、耐盐、耐储藏性，但所制备的食品级植物精油微乳体系其抗菌活性并未如期表现出协同增效作用，反而特性大大减弱，超过了香辛料应用于食品中0.2%最大允许添加范围，因此进一步对微乳体系的微观结构及其抗菌作用机制进行系统性探索，有利于解决植物精油乳化体系作为“高效、安全、广谱”的无防保鲜剂在食品领域中应用的瓶颈。