牛结核γ-干扰素ELISPOT方法在奶牛结核病检疫的应用

杨显超 李凯航 陶田谷晟 赵洪进 杨德全 吴秀娟 卢军 王建

（上海市动物疫病预防控制中心 201103）

众所周知，牛结核病是一种慢性人畜共患病，传染范围广和传染力强，该病严重损害整个畜牧业，威胁到人类健康[1]。该传染疾病非常重要的一个途径就是通过乳制品感染人。酶联免疫斑点试验 （ELISPOT） 是一种细胞免疫学检测方法，在单细胞水平上基于高通量检测机体分泌的抗体或细胞因子，从而得出我们所需，它其实就是ELISA 检测技术的外延[2]。因为ELISPOT 敏感性和特异性高，已被广泛用于各种传染病的检测。本研究旨在通过细胞免疫学手段，通过课题前期建立的牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测平台，为日后基于此类方法进行牛结核病的检测和采取相应的防控措施，奠定科学的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

上海某区5 个奶牛场共有1687 头奶牛，每年两次检疫使用颈部皮内变态反应 （SICT），出现阳性或可疑牛再对其及周围接触较为密切的牛只进行γ 干扰素ELISPOT 检测，目的在于更好的净化牛结核病。

1.2 主要试剂、设备

牛结核菌素购自某生物科技有限公司，试剂批号201008；牛γ-干扰素ELISPOT 检测试剂盒购自上海欣博盛生物科技有限公司，批号 3119-4HPW-2。酶标读数仪 Tecan Sunrise；酶联斑点图像自动分析仪 （CTL ImmunoSpot S6）。

1.3 牛结核变态反应试验

奶牛结核病按照国家标准 （GB/T18645-2002），用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验进行奶牛结核病检测。判定标准为局部炎性反应明显，皮厚差≥4mm 判定为阳性牛；局部炎性反应不明显，2mm≤皮厚差＜4mm 判定为可疑牛；无炎性反应，皮厚差＜2mm 判定为阴性牛[3]。

1.4 ELISPOT 方法检测

1.4.1 牛外周血单核细胞的制备

奶牛尾静脉无菌抽取至少3ml 肝素抗凝血，吸取2ml 血与灭菌生理盐水 1：1 混合后，缓缓地加入含3ml 牛淋巴细胞分离液的离心管中，400g 离心20min。这时，外周血单核细胞聚集在云雾状层中，吸取单核细胞层加入灭菌PBS 混匀后，200g 离心10min，重复以上步骤两次。弃去上清，加入1640 培养基重悬，用细胞计数仪进行计数。

1.4.2 牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测

按试剂盒说明书进行操作。大致步骤为在96 孔滤膜板中每孔加入 100μl 2.5μg/ml 的牛 γ 干扰素抗体 MT17.1，4℃包被过夜。在包被的板中，一份样品分 3 管加入 50μl 培养液、10μg/ml 的 禽 型 PPD、10μg/ml 的 牛 型 PPD。然 后 加 入50μl1.25×105细胞数的外周血单个核细胞悬液，置于 37℃、5%CO2培养箱培养 24h；取出弃培养上清，洗板 5 次，加入100μl牛 γ-干扰素检测抗体 MT307-biotin （0.25μg/ml），室温孵育2h；洗板 5 次，加入 100μl HRP，37℃孵育 1h；加入 100μl 底物，室温避光显色。加入纯净水终止反应，移除液体晾干；将96 孔板放入CTL ImmunoSpot S6 中，对实验结果进行扫描计数和分析[4]。

1.5 ELISPOT 同步检测牛结核病临床样品

用1.3 方法检测上海某区5 个奶牛场的1687 头奶牛，选取阳性、可疑牛及其周边密切接触的牛群228 头，采集其全血样品进行ELISPOT 检测，具体参照1.4 和1.5 步骤进行。

2 实验结果

2.1 变态反应检测结果

一共对5 个奶牛场1687 头奶牛进行颈部皮内变态反应（SICT），根据国家标准进行判定，共检出牛结核病阳性牛13头，阳性率为0.77%，阳性牛未表现出明显的临床症状；检出结核病可疑牛36 头，其余皆为阴性。

2.2 牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测结果

颈部皮内变态反应 （SICT） 全检 1687 头奶牛后，将阳性牛、可疑牛及其密切接触牛228 头牛进行γ 干扰素ELISPOT 检测，出现15 例牛结核分枝杆菌阳性、213 例阴性。

2.3 两种方法符合率的比较

对上海存栏为1687 头奶牛进行颈部皮内变态反应（SICT），参见附表。共有 13 头阳性奶牛，36 头可疑牛检出，其余均为阴性，阳性牛未表现明显的临床症状。抽取228 头阳性牛、可疑牛及其密切接触牛228 头牛抗凝血进行牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测，结果牛型结核病阳性15 份，阴性213 份。说明牛结核PPD 皮内变态反应结合γ 干扰素ELISPOT 可以有效提高牛结核病检疫的准确性，减少因单纯使用颈部皮内变态反应 （SICT） 出现的假阴性现象。在变态反应可疑牛中，仍然检出了2 份γ-干扰素ELISPOT 阳性牛，两者阳性符合率93%，阴性符合率99%。

附表 ELISPOT 方法与PPD 的比较 (单位：头)

3 讨论

酶联免疫斑点检测技术 （ELISPOT） 是近些年发展起来的新技术，是一种基于检测细胞因子的免疫学方法。该方法是将细胞培养与ELISA 技术结合起来新构建的一种检测技术，是在单细胞培养水平上体外检测特异性细胞因子。可以对细胞因子分泌量进行方便快速的定量检测，目前已经是国际上一项主流的免疫学检测技术。并且ELISPOT 检测技术也在动物研究领域具有广阔的应用前景[5]。

γ-干扰素ELISPOT 在结核病诊断上有很大意义，但在某些方面仍有一定的局限性。一是ELISPOT 检测技术能检测牛结核分枝杆菌，但其结果不能作为标准来直接判定是否为活动性结核病，且敏感性不是很高，因此在牛结核流行污染地区不能单独用此方法来排除结核病的类型[6]。二是环境中的结核分枝杆菌能明显影响ELISPOT 的结果，环境的暴露强度与该病的检测有正相关性[7]。因此，运用该检测方法作为单一判断标准可能会对结果造成误诊，故需要针对不同地区和不同牛群调整监测策略。三是此方法需要分离机体的外周血淋巴细胞，这对实验人员的操作水平提出要求。最后，由于ELISPOT 检测的费用高，使其较难进行大范围的推广和应用。免疫学检测技术的不断发展，ELISPOT 在动物疫病诊断的领域的应用也会更加深入，我们相信该技术会逐渐成为结核病实验室诊断的候选检测技术。