一株水貂细小病毒分离与鉴定

卢军霞 董炳梅

（1，河北石家庄工程职业学院 050000；2，山东绿都生物科技有限公司 256600）

水貂病毒性肠炎是由水貂细小病毒引起的一种以剧烈腹泻为主要特征的急性、烈性、高度接触性传染病，是危害水貂养殖业的 3 大疫病之一[1,2]。本病多发生于 7～9 月份，传染源多为患病/带毒水貂，其传播途径主要为经口与呼吸道传播[3]。患病貂场如不及时采取有效措施加以控制，该病常会引起地方性、周期性流行，且第二年仔貂断乳前后有再次发生的可能。该病毒对外界环境具有较强的抵抗力，在污染的笼舍可存活5～10 个月[4]；冷冻状态下，其毒力可维持一年不下降；56℃30min 可使该病毒灭活；但水貂细小病毒对福尔马林与苛性钠比较敏感，0.5%福尔马林或2%苛性钠溶液，室温12h 可使该病毒失去活力，这也是该病难以根除的原因之一。近年来，随着毛皮动物养殖规模与养殖密度的不断扩大，因免疫程序不合理及饲养条件差等原因，该病在我国水貂养殖区仍时有发生[5]。

山东某水貂养殖场养水貂约2000 只，近期陆续出现体温升高、厌食、呕吐、腹泻等症状，粪便呈浅黄色与煤焦油样，且断奶仔貂发病率高于成年水貂。该貂场发病率为52.3%，死亡率为65.8%。剖检可见心外膜出血，胃黏膜有点状出血，小肠肠壁变薄，肠黏膜出血，肠内容物含有黏稠的纤维素性物质多呈暗红色，肠系膜淋巴结肿大充血。综合以上症状及剖检变化，结合该貂场免疫情况，初步判断为水貂细小病毒感染。通过一系列的防控措施使该病得以有效控制，从而为本地区该类疾病的诊疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞

猫肾传代细胞系F81，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 鉴别用血清

1.1.3 试剂

DMEM 培养基购自 GIBCO 公司。PCR 10×buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs 购自宝生物 （大连） 生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 水貂肠炎病毒的分离

取山东省某水貂养殖场送检的疑似水貂细小病毒感染的水貂粪便，加适量的生理盐水，-20℃反复冻融 3 次，10000r 离心 20min，取上清液，经 0.22μm 微孔的滤膜过滤，加入青、链霉素至100U/ml，置于-70℃保存备用。

1.2.2 PCR 检测

取处理好的病料，应用酚氯仿抽提法提取总DNA 作为模板，应用 PCR 方法进行扩增。PCR 反应体系为 25μl，其中含有 10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，MgCl2 2.5μl，Taq 酶 1μl，引物1 和 2 各 1μl，DNA 模板 0.5μl，去离子水 16.5μl。PCR 反应程序为：95℃预变性 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸10min，冷至4℃保存。经琼脂糖电泳检测，所扩增目的片段为600bp。上、下游引物分别为：

MEV-1：5’ -GTAAGCTTCCAGGAGACTTT-3’

MEV-2：5’ -GTAAGCTTCGTCGTGTTCTT-3’

1.2.3 病毒分离

将F81 细胞按常规方法进行传代培养，将上述处理的滤液，同步接种于F81 细胞中[6]，接毒量为细胞培养液的1/10，置于37℃培养箱中，观察5～7d，并盲传三代，同时设1 瓶正常细胞对照。

1.2.4 水貂肠炎病毒的鉴定及生物学特性的测定

1.2.4.1 PCR 鉴定

将细胞培养物反复冻融3 次后，10000r 离心20min，取上清，按照1.2.2 的方法进行PCR 鉴定。

1.2.4.2 红细胞凝集谱的测定

应用微量凝集试验，将鸡、猪、绵羊、豚鼠、小白鼠、兔子与人O 型红细胞0.015 M pH6.5 的PBS 缓冲液稀释成1%的红细胞悬液，按常规方法测定细胞培养物的血凝特性，以50%以上红细胞凝集判定为红细胞凝集阳性。

1.2.4.3 对流免疫电泳试验

将细胞培养物与水貂细小病毒阳性对照病毒加入氯仿抽提10min，3000r 离心 10min，取上清液备用。用 pH8.6 0.025mol/L的巴比妥缓冲液配制1%的琼脂凝胶，冷凝后打孔，在相对的2孔内分别加入抗原与血清。加样后，置于电泳槽内进行电泳。在抗原孔和血清孔之间出现白色沉淀线判为阳性，不产生沉淀线者判为阴性。

1.2.4.4 细胞培养物毒力的测定

（1） HA 效价的测定

将细胞培养物用0.015M pH6.5 的 PBS 缓冲液进行2x 倍比稀释后，加入1%猪红细胞，4℃作用 60min，观察红细胞凝集情况，计算HA 效价。

（2） TCID50 的测定

将F81 细胞进行常规传代，加入96 孔细胞培养板中。随后应用细胞培养液将细胞培养物进行10x 倍比稀释，采用同步接毒法，加入含有 F81 细胞的 96 孔板中，100μl/孔，置于 37℃5% CO2培养箱中培养7d，观察并记录细胞病变情况，应用Reed-Muench 法计算分离病毒的TCID50。

1.2.5 动物感染试验

选取血清 HA 效价≤1：4 的健康易感水貂 6 只，其中 4 只灌服 15ml 细胞培养物，另 2 只作为对照，灌服 15ml 正常 F81 细胞培养液，隔离观察，并于每天观察记录临床症状、收集粪便，10d 后对所有水貂进行剖杀，观察肠道等脏器的病理变化。

2 结果与分析

2.1 PCR 检测结果

将处理好的病料提取基因组作为模板，进行PCR 扩增。结果显示，扩增出一条600bp 左右的片段，初步判定该场水貂携带有水貂细小病毒 （图1）。

2.2 病毒的分离与鉴定

2.2.1 疑似水貂细小病毒的分离

将处理好的病料按同步接毒的方法接种F81 细胞后，观察5～7d，并盲传 3 代。传代至 F3代，可见明显的细胞病变，局部细胞圆缩、拉网，随后逐渐扩展，直至细胞溶解脱落 （图2）。

2.2.2 水貂细小病毒的鉴定

取疑似水貂细小病毒感染病料的细胞培养物F3 代，常规方法提取模板DNA，经PCR 检测，证明该细胞培养物为水貂细小病毒阳性。红细胞凝集谱测定结果显示，该细胞毒只可凝集猪红细胞，其余红细胞均不发生凝集反应。应用对流免疫电泳测定结果显示，细胞培养物、水貂细小病毒阳性对照与水貂细小病毒阳性血清均出现沉淀线，进一步证明细胞培养物为水貂细小病毒。

2.3 分离病毒毒力的测定

盲传三代后，TCID50检测结果显示，该细胞毒TCID50为10-5.68/0.1ml；HA 效价测定结果显示，该分离病毒的血凝价为 1：256。

2.4 水貂感染性试验

将细胞培养物接种健康易感水貂4 只，隔离观察，接种后4d，水貂出现减食、排稀便现象；接种后 5～7d，4 只水貂均出现厌食甚至废食、体温升高、脱水、套管样粪便与血便；对照组正常，无任何不良症状。将4 只发病水貂进行剖检，可见尸体消瘦、肠道黏膜变薄、充血、出血，肠道内混有红色血状物。

3 讨论

水貂细小病毒属于细小病毒科，细小病毒属。其中肉食兽细小病毒主要包括貂细小病毒、犬细小病毒、貉细小病毒和蓝狐细小病毒等[7,8]。细小病毒在自然界分布极为广泛，且对外界因素具有强大的抵抗力[9]。水貂细小病毒在加拿大安大略省威廉堡地区1947 年首次发生，而该病在我国于1974 年才首次报道，此后逐渐蔓延至全国，给水貂养殖业造成巨大的经济损失[10]。目前，在我国水貂细小病毒的预防主要是免疫接种，但近年来疫苗免疫失败的现象屡有发生。在本研究中，由于该养殖场一段时间内应用毛蛋等不良饲料原料，导致水貂抵抗力降低，且轻度腹泻，也因此错过了水貂细小病毒的最佳免疫时间，最终导致该病的发生。

水貂细小病毒病的特点为病程短、病情极易恶化。目前，水貂细小病毒尚无有效的药物与治疗方法，其治疗原则主要是切断传播途径，中和病毒，对症治疗，防止继发感染[11]。在该养殖场，首先停用不良饲料原料，并对笼舍、场地等进行严格的消毒工作，对死亡的水貂采取无害化处理；其次隔离病貂，并肌肉注射高免血清与抗生素，同时全场应用葡萄糖及多种维生素饮水；最后应用水貂肠炎灭活疫苗进行紧急接种，小于3月龄的仔貂 3 头份/只，3 月龄以上的貂 5 头份/只。经过一段时间的处理，该病得到良好的控制。