PCL生物反应器中催化合成乙酸正戊酯

任德忠，丛方地,,通信作者，王晓红，张蒙，王鑫鑫，张树林，罗巍

（1.天津农学院 基础科学学院，天津 300384；2.天津市水产生态与养殖重点实验室，天津 300384）

乙酸正戊酯是一种具有香蕉气味的无色透明液体，是重要的香料和专用有机溶剂，广泛应用于食品、医药、涂料、印染等领域，在国内外有广阔的需求市场[1]。现有的酯合成工艺中，使用的催化剂多为杂多酸、负载杂多酸、固体超强酸及无机化合物[2]，且多在高温、强酸或微波条件下催化反应，难以避免高能耗、酸碱腐蚀、重污染等问题[3]。为克服这些不足，人们正探索生物催化合成方法，如酶催化，具有反应条件温和、绿色、高效、低碳、高选择性等诸多优点[4-5]。但酶制剂价格通常较贵，使用成本高。然而，酶固定化后不但催化反应转化率有很大提高[6]，而且也可提高酶的稳定性[7]。此外，使用固定化酶催化反应产物的分离和纯化更便利[8]。在前期研究的基础上[9-15]，本研究将假单胞菌脂肪酶Pseudomonas cepacialipase（PCL）固定在脱脂棉纤维上，并与反应装置一起制成生物反应器，催化正戊醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应合成乙酸正戊酯，取得较好的催化效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器：恒温摇床（HZQ-X）、气相色谱仪（Echrom A90）、电子天平（FA2104A）、移液枪（200 μL、1 000 μL）、恒温水浴锅（HH-3）。试剂：假单胞菌脂肪酶（PCL，33 U/mg）酶粉购于Sigma Co., Ltd.公司，正戊醇、乙酸乙烯酯、无水乙醇、正己烷和其他有机溶剂皆为分析纯。医用脱脂棉购于市场，参考相关研究[10]，取10 g脱脂棉置于烧杯中，加入无水乙醇直至完全浸没脱脂棉，用保鲜膜封口，室温下浸泡2 d。用镊子将脱脂棉取出放入干净的烧杯中，再次加入无水乙醇浸泡1 d。然后用镊子将脱脂棉取出放入干净的烧杯中，用多层纱布将烧杯口封好，室温下自然晾干，使用时用镊子将其拉至蓬松。

1.2 PCL在脱脂棉上的固定化

参考参考文献[9]，称取10 mg PCL酶粉，放入容积为10 mL的柱形玻璃瓶中，加入0.2 mL蒸馏水，轻轻摇晃使酶粉溶于水。称取10 mg处理过的脱脂棉，加入玻璃瓶中，让脱脂棉充分吸附酶溶液。然后将玻璃瓶敞口置于摇床中，在37 ℃、160 r/min条件下保持7 h以上[10]，用镊子将瓶内脱脂棉拉至蓬松状态，得固定化酶脱脂棉-PCL，连同柱形瓶一起形成脱脂棉-PCL瓶型反应器，见图1（a）。

图1 脱脂棉-PCL瓶型（a）和管式（b）反应器

称取10 mg PCL酶粉放在表面皿中心，加0.2 mL蒸馏水充分溶解酶粉，称取10 mg处理过的脱脂棉放置于培养皿上，使其充分吸附酶溶液，然后将表面皿放置在恒温箱中，在37 ℃条件下保持90 min以上，挥发掉水分，用镊子将脱脂棉撕拉至蓬松，得脱脂棉-PCL，可放入10 mL的柱形玻璃瓶或滴定管中使用。

1.3 酶催化合成乙酸正戊酯反应

分别在含有脱脂棉-PCL和PCL酶粉的10 mL柱形玻璃瓶中加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，盖上瓶盖并用保鲜膜密封，在37 ℃、160 r/min条件下催化反应。每个反应体系中的PCL酶粉质量都是10 mg。另外，按照上述方法配制同样的两个反应体系，置于37 ℃恒温水浴锅中静置反应。以上所有的反应体系每2 h进行取样分析。

另在 6个脱脂棉-PCL反应器中，分别加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，盖盖并密封，静置在不同温度下，催化反应24 h，取样分析。在6个脱脂棉-PCL反应器中，分别加入1 mL正戊醇和2-7 mL的乙酸乙烯酯，盖盖并密封，静置在 37 ℃条件下催化反应 24 h，取样分析。在 6个脱脂棉-PCL反应器中，分别加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，再分别加入1-6 mL体积不等的正己烷，盖盖并密封，静置在37 ℃下催化反应24 h，取样分析。

1.4 脱脂棉-PCL瓶型反应器重复催化反应

在1个脱脂棉-PCL反应器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，盖盖并密封，静置在37 ℃下催化反应24 h，取样分析。然后，将反应液倾出，并用少量正己烷清洗3次，敞口放置15 min，使正己烷挥发完全。重新向此反应器中加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，盖盖并密封，静置在37 ℃下催化反应24 h，取样分析。如此循环操作6次。

1.5 不同种脱脂棉-PCL催化合成乙酸正戊酯

在脱脂棉-PCL瓶型反应器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，盖盖并密封，恒温37 ℃水浴静置催化反应，并按时取样分析。另在10 mL柱形玻璃瓶中，加入在表面皿中固定而得的脱脂棉-PCL（脱脂棉10 mg），如上加入相应量的反应液，并在同样条件下催化反应后取样分析。

1.6 脱脂棉-PCL管式反应器中催化反应

将表面皿中固定而得的脱脂棉-PCL（脱脂棉50 mg）撕拉蓬松，装入酸式滴定管中构成脱脂棉-PCL管式反应器，见图1（b），将正戊醇与乙酸乙烯酯按体积比1∶2混合均匀后加入到酸式滴定管中，待脱脂棉与溶液充分接触后开始计时，1 h后，打开滴定管阀门，将与棉花接触的反应液放出，关闭阀门，对流出液取样分析。此后，逐渐延长催化反应时间，并放出反应液，取样分析。

1.7 样品色谱分析方法

每次分析，取20 μL反应液，用1 mL正己烷稀释，0.25 μm滤膜过滤，进行GC分析，色谱条件为：氮气（0.4 MPa，分流比 1∶1），65 ℃，保留3 min；15 ℃/min，130 ℃，保留1.5 min。进样和检测温度分别为280和300 ℃。正戊醇和乙酸正戊酯的保留时间分别为2.6、4.6 min。根据正戊醇和乙酸正戊酯的峰面积计算底物的摩尔转化率[15]。

2 结果与分析

2.1 摇动和静置条件下的酶促反应

将脱脂棉-PCL瓶型反应器中的脱脂棉撕成蓬松，可尽可能增大其比表面积[11]，进行催化反应时，反应液与酶的接触面得以增大，以提高酶催化反应的效率。在37 ℃、分别静置和摇动条件下，脱脂棉-PCL与PCL酶粉催化正戊醇和乙酸乙烯酯反应生成乙酸正戊酯。由图2可见，相对于PCL酶粉，脱脂棉-PCL转化底物的能力明显较高，2 h后，脱脂棉-PCL催化转化底物的能力约为PCL酶粉的3倍。摇动和静置条件相比较，无论酶粉还是固定化酶，在两种条件下的转化能力相近，这可能是由于脱脂棉-PCL固定化酶有较大比表面积的原因。因此，可以选在静置条件下进行酶催化反应，以达到更低碳的效果。

图2 37 ℃下的酶促反应动力学

2.2 温度对脱脂棉-PCL催化效果的影响

酶的本质是蛋白质，温度对酶的构象有较大影响，以致影响其催化作用[16]。在静置和不同温度下，脱脂棉-PCL瓶型反应器催化正戊醇和乙酸乙烯酯反应24 h的效果见图3。室温（25 ℃）下，反应体系的转化率即可达 97%。可见，此反应器可在静置和常温下有效催化反应，达到更低碳催化的效果。

图3 脱脂棉-PCL瓶型反应器中反应转化率

2.3 反应底物比和溶剂用量对脱脂棉-PCL催化效果的影响

在酶促反应中，当某一底物浓度固定，反应受底物摩尔比的影响十分显著[17]。在6个脱脂棉-PCL反应器中分别加入 2-7 mL乙酸乙烯酯，在37 ℃、静置条件下，催化反应24 h，得到如图4所示结果。加入不同量的乙酸乙烯酯，酯转化率出现较小的波动，波动幅度不超过1%，都在99%以上。基于此，在正戊醇用量为1 mL时，乙酸乙烯酯的用量取最小体积，即2 mL。

图4 酰化试剂和溶剂对酶促反应转化率的影响

醇类物质有一定的粘稠性[18]，在反应中有可能影响反应器的酶促转酯能力。在 6个脱脂棉-PCL瓶型反应器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，再分别加入1-6 mL的正己烷。在37 ℃、静置条件下，反应24 h，结果如图4。可见，加入正己烷的量对转化效率的影响并不大，转化率几乎接近100%，原因可能是正戊醇在2 mL乙酸乙酯中可以充分地被分散，其粘稠度已经不再对转化率产生较大影响，无需再向反应体系中加入小分子溶剂进行稀释。

2.4 脱脂棉-PCL瓶型反应器活性的稳定性

固定化酶催化活性的稳定性对于其应用于催化反应非常重要[19]，为验证脱脂棉-PCL催化活性的稳定性，脂棉-PCL被重复使用于6次催化反应，每次催化24 h，结果见图5（a）。参考文献相关研究[20]，以第一次催化反应后的转化率作为固定化酶在非水相条件下的初始活力，即 99.4%。以第六次催化反应后的转化率作为衰减后的酶活力，也就是再重复利用5次后的酶活力，即77.4%。那么，脱脂棉-PCL的反应活力衰减率为（99.4%-77.4%）÷（24 h×5）＝0.18%/h。相对于类似的催化反应[21]，此脱脂棉-PCL催化活性的稳定性不够理想，但比PCL酶粉的催化效果好[10]。尽管如此，重复利用5次的脱脂棉-PCL可通过重复固定化操作而活化，活化后其催化反应24 h后，转化率达90.0%，见图5（b）。虽然其催化反应的转化率没有达到初始 99.4%，但相对于衰减后的转化率77.4%，提高了12.6%。可见，脱脂棉-PCL可多次重复利用，其活力衰减后，可通过加水重新固定再次提高酶催化活性。

图5 脱脂棉-PCL瓶型反应器重复催化反应的转化率（a）及使用6次后的GC谱图（b）

2.5 不同种脱脂棉-PCL的催化效果比较

脱脂棉-PCL可以在柱形瓶中也可以在表面皿中固定制备。两种脱脂棉-PCL在柱形瓶中，在相同条件下催化反应的动力学如图6所示。由图可见，在玻璃瓶中固定得到的脱脂棉-PCL（脱脂棉10 mg）催化效率较高，在反应2 h时，其催化反应的转化率是表面皿中固定所得脱脂棉-PCL（脱脂棉10 mg）催化反应转化率的2.2倍，尽管如此，后者的活性相对于酶粉还是较高的（图2）。这可能是因为后者在从表面皿转移到玻璃瓶的过程中，酶会有部分损失，通过称量估算，其平均损失率约 9.3%。虽然，表面皿中固定所得脱脂棉-PCL的催化效率相对于柱形玻璃瓶中固定所得脱脂棉-PCL较低，但在反应时间达到24 h后，其转化率也达到了77.0%（图6）。此外，在柱形玻璃瓶中制备脱脂棉固定PCL，水分挥发慢，在37 ℃、160 r/min条件下固定10 mg的PCL需7 h，而在表面皿上制备脱脂棉-PCL，仅需1.5 h，大大缩短了固定化操作的时间。

图6 两种脱脂棉-PCL酶促动力学（37 ℃、0 r/min）

2.6 脱脂棉-PCL在滴定管中催化反应

将表面皿中固定的脱脂棉-PCL装入酸式滴定管中，尽可能保持脱脂棉蓬松，并加入反应液，催化反应，如图1（b）。通过对流出反应液分析发现，反应产率随时间的延长而增大，室温下反应5 h，产率达到73.6%，继续延长反应时间产率增加变小（图7）。这可能是因为，在这种反应器中，上部反应液与下部接触脱脂棉-PCL的反应液间没有隔离，导致上下反应液间通过分子运动而混合，使试验测定结果偏低。在今后的试验中，将进一步改进这种脱脂棉-PCL管式反应器，提高酶促转化率，以达到室温和静置条件下间歇式制备乙酸正戊酯的效果。

图7 脱脂棉-PCL管式反应器中酶促反应动力学

3 结论

在本试验中，以脱脂棉纤维为固定化载体材料，通过物理吸附，将PCL酶固定在脱脂棉上，与反应装置一起构成简易的生物反应器，用于催化正戊醇和乙酸乙烯酯反应合成乙酸正戊酯，达到了较好的催化效果。在脱脂棉-PCL瓶型反应器中，25 ℃、静置条件下，反应24 h，转化率可达97%。相较于传统催化方法的强酸强碱、高温等催化条件，脱脂棉-PCL催化反应具有操作简单，且低碳、高效的特点。在脱脂棉-PCL管式反应器中，常温静置的条件下，经5 h的催化，也达到了较好的催化效果，有望将来改造成间歇式生产重要酯类化合物的绿色、低碳生产设备。