不同乳杆菌强化发酵红薯叶及其酸菜品质的研究

宋文华 何 佳 袁江月 芮 蓬 刘锡铭

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 洛阳市微生物发酵工程技术研究中心，河南 洛阳 471023)

红薯叶有促进新陈代谢、抗氧化、抗肿瘤、抑制病菌等保健功能，氨基酸模式与联合国粮食及农业组织推荐的基本一致[1]。目前有关红薯叶功能性成分分析的研究报道较多，如傅莉等[2]研究发现，红薯叶黄酮能提高2型糖尿病大鼠的免疫能力；徐龙权等[3]研究发现，红薯叶多糖对细菌的抑制能力大于苯甲酸钠；吴忆微等[4]表明，红薯叶功效成分能抑制肿瘤细胞生长。中国红薯叶产量大，却因其储存性差，易腐烂，目前主要以鲜食为主，仅有红薯叶粗粮馒头[5]、保健饮料[6]、保健醋[7]等少数几种产品，难以满足市场需求，红薯叶深加工技术和工业化生产已成为众多研究者关注的热点。

酸菜是中国传统的发酵制品，在微生物作用及一系列生化反应下，呈现特有的口感和风味，货架期较长[8]。目前已有胡萝卜、甘蓝、白菜等30多种风味酸菜[9]，但是有关红薯叶酸菜的研究鲜有报道。传统发酵酸菜由于大量杂菌生长繁殖，常常存在亚硝酸盐含量高、发酵时间长及品质不稳定等突出问题[10]。而众多研究表明，接种发酵方式能够解决上述难题，吴映明等[11]研究发现，接种乳酸菌发酵泡菜能明显降低亚硝酸盐含量；崔松林等[12]研究发现，接种嗜酸乳杆菌发酵白菜能缩短发酵周期，提高产品安全性。但是有关乳酸菌发酵红薯叶及其酸菜品质的研究鲜有报道。试验拟以红薯叶为原料，基于传统发酵酸菜，接种不同乳酸菌进行强化发酵，以期为红薯叶的再利用和规模化加工提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

红薯叶：河南科技大学农学院红薯实验田；

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，HZLp-005)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，HZLr-023)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，HZLa-008)：实验室保藏；

食用盐：河南洛阳大张实业超市；

果葡糖浆：F55，商丘市饮之健生物科技有限公司；

硝酸钾：基准试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司；

亚硝酸钠：基准试剂，上海市化学试剂一厂；

阳离子交换树脂：732型，天津四科密欧化学试剂有限公司；

42种游离氨基酸标样：德国曼默博尔公司；

MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司；

3,5-二硝基水杨酸：化学纯，上海强顺化学试剂有限公司；

N-1-萘乙二胺盐酸盐：分析纯，天津市光伏精细化工研究所；

无水乙醇、亚铁氰化钾：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；

乙酸锌：分析纯，天津市博迪化工有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电热恒温水浴锅：HH-S4型，北京科伟永兴仪器有限公司；

生化培养箱：SPX-250型，北京市永光明医疗仪器公司；

高速冷冻离心机：TGL-16M型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

分光光度计：UV-2100型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

食品物性分析仪：TA.XT Epress Enhanced型，英国SMS公司；

超声清洗仪：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE 52-86A型，上海亚荣生化仪器厂；

全自动氨基酸全自动分析仪：A300型，德国曼默博尔公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与扩培 将前期试验确定的3种乳酸菌分别置于MRS液体培养基中活化，37 ℃静止培养18 h，将活化好的菌悬液分别按1∶10扩大培养18 h。

1.2.2 红薯叶酸菜的发酵 红薯叶清洗、入坛，以坛内总体积计，植物乳杆菌组、嗜酸乳杆菌组、鼠李糖乳杆菌组、混合乳酸菌组(植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌=2∶3∶2)4个乳酸菌强化发酵处理组分别加入2%乳酸菌菌悬液、0.8%果葡糖浆和2%食盐，以只加2%食盐为自然发酵对照组。加水至满坛，密封，25 ℃发酵10 d。

1.2.3 食盐的添加量 前期试验中，在相同食盐浓度下4个处理组发酵终点时的酸菜pH值差异不显著，但混合乳酸菌组乳酸含量较高。故以混合乳酸菌为发酵菌种，考察发酵过程中食盐量对乳酸菌发酵红薯叶酸菜的影响。试验具体步骤：在装有待发酵红薯叶的菜坛中加入2%的混合乳酸菌菌悬液和0.8%的果葡糖浆，设3个食盐添加组，添加量分别为2%，4%，8%，25 ℃强化发酵5 d。

1.2.4 乳酸含量的测定 酸碱滴定法。

1.2.5 亚硝酸盐的测定 盐酸萘乙二胺法[13]，标准曲线方程为y=0.738 8x-0.001 4，相关系数R2=0.999 2。

1.2.6 硝酸盐的测定 双波长紫外分光光度法[14]，标准曲线方程为y=0.238 1x-0.007 8，相关系数R2=0.999 6。

1.2.7 可溶性多糖含量的测定 3，5-二硝基水杨酸法[15]，葡萄糖标准曲线方程为y=0.930 2x-0.049 3，相关系数R2=0.995 5。

1.2.8 剪切测试 参照刘刚等[16]的方法，采用刀片探头(AMORS型)，测前速度1 mm/s，测试速度1 mm/s，测后速度1 mm/s，剪切距离8 mm，触发力5.0 g，切到样品断开，得到红薯叶被切断时的硬度、咀嚼性和紧实度等指标。

1.2.9 游离氨基酸的提取 强酸型阳离子树脂交换法[17]。取1.00 g红薯叶粉末置于锥形瓶，加蒸馏水50 mL，超声1 h，取出后加亚铁氰化钾和乙酸锌溶液，70 ℃ 水浴15 min，降温过滤得粗提液，将粗提液浓缩后缓慢流入处理好的树脂柱，先用蒸馏水冲洗后用80%乙醇冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后用4 mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，65 ℃旋转蒸发，浓缩洗脱液至一定体积，收集样液备用。

1.2.10 游离氨基酸含量的测量 高效阳离子交换色谱(HPCEC)—柱后茚三酮衍生化法[18]。进样量20 μL，柱温40 ℃，反应器温度70 ℃，茚三酮溶液流速180 μL/min。

2 结果与分析

2.1 食盐量对乳酸菌强化发酵酸菜pH的影响

为确保发酵顺利进行，中国传统酸菜的食盐添加量较高，为2%～10%[19]，大量添加食盐虽可抑制杂菌污染，但大大减缓发酵进程，同时食盐量过高对健康不利。从图1可看出，食盐含量越低，pH下降越快，越早降至最低pH值。食盐量2%的酸菜pH下降速率更快，pH值始终低于食盐量4%和8%。原因是较高的食盐量抑制乳酸菌活性，影响乳酸生成，而pH值是判断发酵程度的重要指标之一，pH快速降低对防止杂菌污染至关重要。因此，考虑乳酸菌迅速产酸和低盐饮食理念，以及酸菜的品质，选择食盐量为2%进行后续研究。

图1 食盐含量对酸菜pH影响

2.2 不同乳酸菌强化发酵对酸菜pH和乳酸含量的影响

据报道，酸菜成熟pH在3.0～4.0[20]，其乳酸含量为6～8 g/kg时口感最佳[21]。从图2可看出，乳酸菌强化发酵酸菜pH下降速率比自然发酵要快，第1天pH值降至3.1～3.5，第10天pH值基本稳定在3.05～3.22，混菌发酵pH下降最快，最先接近发酵终点，而自然发酵pH第4天才降到3.5，第10天pH为3.35。从图3可看出，乳酸菌强化发酵产酸快，乳酸含量高于自然发酵。第10天，混菌发酵乳酸含量为6.19 mg/g，单菌发酵在5.25～5.40 mg/g，而自然发酵乳酸含量为4.75 mg/g。由此判断，第10天时混菌发酵红薯叶酸菜成熟，而单菌发酵和自然发酵均未成熟。可能原因是植物乳杆菌产酸能力强，在短时间内成为优势菌种，整个发酵过程占主导地位[22]，嗜酸乳杆菌产酸快，并且耐酸能力强，鼠李糖乳杆菌发酵初期产酸慢，但其耐酸能力强，在发酵中后期产酸量大，而自然发酵存在大量杂菌，乳酸菌含量少且产酸能力弱。试验结果与黄慧福等[23]研究富源酸菜的结果相似。以上结果表明，乳酸菌强化发酵过程中发酵启动快，乳酸增加快，pH下降迅速，混菌发酵可以缩短时间，提高酸菜的安全性。

2.3 不同乳酸菌强化发酵对亚硝酸盐和硝酸盐含量的影响

亚硝酸盐是酸菜发酵过程中常见产物，是亚硝胺合成的前体物，而接种乳酸菌能够减少亚硝酸盐产生。从图4可看出，在第18 h，植物乳杆菌组、嗜酸乳杆菌组、鼠李糖乳杆菌组和混菌组出现“亚硝峰”，峰值分别为16.98，12.87，16.86，11.85 μg/mL，均低于食品安全标准(20 mg/kg)。而自然组“亚硝峰”出现较晚，且峰值是强化发酵的6～14倍。在第120 h，强化发酵亚硝酸盐含量在0.29～0.45 μg/mL，低于绿色腌制食品亚硝酸盐含量(4 mg/kg)。从图5可看出，在第18 h，强化发酵酸菜中硝酸盐有短暂回升，然后快速下降并趋于平缓，而自然发酵持续下降并趋于平缓。可能原因是发酵初期大量杂菌活性较高，使硝酸盐逐渐被还原，而乳酸菌不含细胞色素氧化酶系统，不能使硝酸盐还原成亚硝酸盐[24]，且其快速产酸能有效抑制还原菌生长。因此，整个发酵过程，强化发酵硝酸盐含量高于自然发酵，而混菌发酵硝酸盐变化与单菌发酵无明显差异。

图2 不同乳酸菌对酸菜pH影响

图3 不同乳酸菌对乳酸含量的影响

图4 不同乳酸菌对酸菜中亚硝酸盐含量的影响

图5 不同乳酸菌对酸菜中硝酸盐含量的影响

张志国等[25]研究香椿泡菜发现，植物乳杆菌对亚硝酸盐起到阻断作用，能够降低发酵过程的“亚硝峰”，与试验研究相似；Park等[26]研究发现乳酸菌在各泡菜类型降解亚硝酸盐发挥重要作用。Yan等[27]研究表明，乳酸菌能使泡菜中硝酸盐还原菌明显减少，并确定阴沟肠杆菌是主要硝酸盐还原菌。以上结果表明，乳酸菌强化发酵能将亚硝酸盐控制到最低，混菌发酵对亚硝酸盐的抑制强于单菌发酵(P<0.05)，能保障红薯叶酸菜食用安全。

2.4 不同乳酸菌强化发酵对红薯叶多糖的影响

红薯叶中多糖含量高于其他蔬菜，是天然保健产物。从图6看出，随着发酵进行，单菌发酵红薯叶多糖含量先迅速减少后缓慢回升至平缓，混菌发酵缓慢下降至平缓，而自然发酵先迅速增加至最高，后快速下降至最低，接着缓慢上升至平稳。第10天，各组多糖含量均保持稳定，分别为植物乳杆菌组25.15 mg/g、嗜酸乳杆菌组27.61 mg/g、鼠李糖乳杆菌组26.88 mg/g，混菌组22.90 mg/g和自然组15.62 mg/g。乳酸菌强化发酵多糖含量差异不显著，但都明显高于自然发酵，且差异显著(P<0.05)。可能是自然发酵中微生物分泌的酶类部分分解纤维素，其在初期对糖的利用速率较低[28]，随着乳酸大量增加，酶的产生及活性受到抑制，纤维素分解过程被阻断。而乳酸菌不具备分解纤维素的酶系统，不会破坏植物细胞组织，因此，乳酸菌强化发酵多糖含量不会上升。以上结果表明，乳酸菌强化发酵形成的酸性环境阻遏了杂菌对多糖的分解利用，较之自然发酵，降低了多糖的损失率。

图6 不同乳酸菌对红薯叶多糖的影响

2.5 不同乳酸菌强化发酵对游离氨基酸的影响

氨基酸的种类越多其功能越齐全。从表1可看出，无论强化发酵还是自然发酵均能增加产品中氨基酸含量。混菌组有24种氨基酸，比自然组多4种，比鼠李糖乳杆菌组多3种，仅在混菌组和鼠李糖乳杆菌组检测到所有必需氨基酸，且混菌组的必需氨基酸含量(1 561.72 μg/g)高于鼠李糖乳杆菌组(1 544.58 μg/g)，占其氨基酸总量的31.82%，其中含量最高的是亮氨酸(505.53 μg/g)，其次是缬氨酸(466.12 μg/g)，含量最少的是赖氨酸(13.72 μg/g)。Kim等[29]研究发现，γ-氨基丁酸具有降血压和抗抑郁等多种生理活性，混菌组γ-氨基丁酸含量(278.23 μg/g)高于各单菌组。谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是酸菜中常见的呈鲜味物质[30]，混菌组谷氨酸和甘氨酸含量最多，分别为596.94，361.70 μg/g，占氨基酸总量的12.21%，7.40%，仅天冬氨酸含量略低(332.79 μg/g)。

以上结果表明，乳酸菌强化发酵对红薯叶中游离氨基酸总量和种类有显著影响(P<0.05)，混菌发酵氨基酸种类更均衡，更符合饮食健康标准。

2.6 不同乳酸菌强化发酵对酸菜质构的影响

从图7可看出，混菌发酵红薯叶硬度呈先增加后平稳的趋势，单菌发酵增加后又减少，而自然发酵波动较大，发酵终点，混菌组硬度为685.94 g，大于其他4组；从图8可看出，5组红薯叶咀嚼性快速增加并趋于稳定，发酵终点，混菌组咀嚼性为3 178 g·s，各单菌组咀嚼性在3 020～3 061 g·s，而自然组最低(2 940 g·s)；从图9可看出，各组红薯叶紧实度不同程度的降低，发酵终点，混菌组红薯叶紧实度为169.78 g·s，各单菌组在135.06～162.43 g·s，而自然组最低(124.52 g·s)。发酵过程中，红薯叶紧实度变化趋势与硬度和咀嚼性变化趋势不同，可能原因是红薯叶细胞间层原果胶被水解，丧失粘连细胞的作用，导致紧实度降低，而细胞膨压减小后又恢复[31]，且纤维素未被分解，使剪切硬度和咀嚼性增加。以上结果表明，乳酸菌强化发酵能够改变红薯叶组织状态，使红薯叶柔软有韧性，混菌发酵对红薯叶硬度、咀嚼性和紧实度等影响明显大于单菌发酵(P<0.05)。

表1 不同样品的氨基酸含量比较†

† 同行字母不同表示差异显著(P<0.05)；“-”表示低于检出限；“*”表示必需氨基酸。

图7 不同乳酸菌对红薯叶硬度的影响

图8 不同乳酸菌对红薯叶咀嚼性的影响

图9 不同乳酸菌对红薯叶紧实度的影响

3 结论

(1) 在25 ℃、食盐量2%条件下，红薯叶混菌发酵乳酸含量最高(6.19 mg/g)，“亚硝峰”峰值最低(11.85 μg/mL)，发酵终点亚硝酸盐含量最低(0.29 μg/mL)，多糖含量(22.90 mg/g)与单菌发酵差异不显著(P<0.05)，发酵时间短，产率高。混菌发酵氨基酸种类最多，其必需氨基酸含量最高(1 561.72 μg/g)，占总氨基酸的31.82%，谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等呈风味氨基酸最丰富。

(2) 乳酸菌强化发酵红薯叶质地柔软坚韧，混菌发酵红薯叶硬度(685.94 g)、咀嚼性(3 178 g·s)和紧实度(169.78 g·s)均最大，可以作为评定红薯叶质构特性的参考。

(3) 后续试验需中试发酵和保藏性研究，对混菌发酵红薯叶进行感官评定、亚硝酸盐检测、挥发性成分分析，以及微生物(乳酸菌、酵母菌、霉菌、大肠杆菌等)的动态变化分析，研究出营养丰富，安全健康，口感独特的红薯叶酸菜，并与相关企业合作实现产业化应用。