除草活性菌株极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)发酵工艺研究

朱海霞，马永强

(青海大学农林科学院，青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，农业部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016)

极细链格孢菌(Alternariatenuissima)HZ-1分离于自然感病的老鹳草植株叶片，由青海省农业有害生物综合治理重点实验室保存.通过前期的纯化及致病性研究，发现该菌株对藜、冬葵等阔叶杂草具有致病力，接种后可导致杂草叶片不同程度的发黄、枯萎，甚至枯死.安全性评价结果显示，该菌株除对春油菜表现不安全外，对当地主栽作物青稞、蚕豆、春小麦和豌豆4种作物表现安全.该菌株有望开发成为春小麦、蚕豆、豌豆和青稞田部分农田阔叶杂草生物除草剂[1].

极细链格孢菌既是重要的植物病原菌，又是非常有应用潜力的生物资源，除了生物除草剂领域，极细链格孢菌在病虫害生物防治、品种选育等方面都具有开发利用价值[2].另外，邱德文等[3]研究发现该菌能产生具有抗病增产功能的蛋白激发子，在促进植物生长、提高产量、改善产品品质等方面具有广泛的利用前景.如果将该菌株开发成菌剂，可为生物农药的开发与利用奠定基础.

生防菌剂的生产与应用，发酵技术是关键[4-5].真菌发酵一般采用液体发酵和液固双相发酵.液体发酵菌剂使用方便，且工艺成熟，但存在菌剂保存时间短，生产成本高，代谢物利用不充分等弊端；而固体发酵具有能耗低，湿度低，培养基来源广泛等优越性[6-8].两种菌剂各有优点，为了满足不同情况下对菌剂剂型的不同需求，本研究拟采用液固双相发酵方式，提高产品质量，降低生产成本.通过单因素试验筛选菌株HZ-1附加碳、氮源和固态发酵底物基质，通过正交试验筛选菌株固液培养优化条件，旨在为该菌的发酵工艺提供科学基础，为实现微生物制剂的产业化发展提供理论依据和指导.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

极细链格孢菌(Alternariatenuissima)HZ-1分离于自然感病的老鹳草，由青海省农业有害生物综合治理重点实验室保存(图1).

图1 HZ-1菌株在PDA培养基上的生长情况Figure 1 Colony growth of HZ-1 strain on PDA medium

1.2 试验设计

1.2.1 生防菌株固态发酵基质的筛选 HZ-1菌株在PDA斜面上培养7 d，加入5 mL无菌水制成菌悬液，按2%的接种量接种于PDB中，180 r/min、25 ℃振荡培养5 d后获得发酵液，稀释成孢子量为1×108个/mL的种子液备用.选取玉米粉、菜籽饼、小麦秸秆、羊粪、麦麸等廉价农副产品下脚料作为固体发酵培养的基本材料，通过生防菌株固体基质发酵初步确定对菌株HZ-1 生长促进作用最大的基质.每100 g固态基质接种25 mL孢子量为1×108个/mL的种子液，搅拌均匀后，置于生化培养箱中25 ℃静置培养8 d，取出发酵产物，自然烘干、粉碎，平板菌落计数法测定不同基质处理的活菌数，分光光度法测其吸光值(OD).每处理设3个重复.

1.2.2 碳、氮源单因素的确定 PDA作为基本培养基，选用6种附加碳源(可溶性淀粉、麦麸、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麦粉)和7种附加氮源(大豆粉、酵母浸粉、硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、尿素、酒糟)，构成13组不同培养基，以不加碳氮源的培养基作空白对照，将配置好的培养基灭菌后，倒皿并于中央接种5 mmHZ-1菌饼.25 ℃培养3 d，测量菌落直径，每处理设置3次重复，筛选出能促进菌株HZ-1生长的碳氮源.

1.2.3 固-液发酵条件的优化 采用L25(57)正交试验法，测定碳源蛋白胨、氮源麦麸、初始pH值、初始含水量、接种量、培养温度、培养时间7种因素对菌株HZ-1发酵的影响.每种因素各取5个水平(表1).选择麦麸作为发酵底物，根据不同配方配制各固态发酵培养基，湿热灭菌后，依次接入孢子量为1×108个/mL的HZ-1种子液，搅拌均匀，置于25 ℃生化培养箱中培养.不同处理发酵物自然风干、粉碎，无菌水溶解过滤去杂质后，采用平板涂布法，以活菌数为指标，进行菌落计数.正交试验共有49个处理水平，设计方案见表2.

表1 菌株HZ-1发酵条件正交试验设计方案

表2 正交试验的不同处理水平

2 结果与分析

2.1 固态基质筛选

不同发酵基质对菌株HZ-1产孢量不同，在等量发酵基质和种子液接入量的前提下，麦麸的产孢量显著高于其他基质，产孢量lgCFU值为8.01，OD值为0.652 4.

表3 不同基质对HZ-1菌粉含孢量和孢子液吸光值的影响

HZ-1在固态基质上的生长状况由优到弱依次为麦麸>小麦秸秆>菜籽饼>玉米粉>羊粪>珍珠岩，玉米粉与菜籽饼处理的产孢量之间不存在显著性差异，玉米粉、菜籽饼和小麦秸秆OD值间不存在显著性差异，其余基质处理间均存在显著性差异.因此，HZ-1最适产孢的固态基质为麦麸.图1显示该菌株在麦麸基质上的生长情况.

2.2 附加碳源和氮源的筛选

HZ-1在不同碳氮源培养基上的菌落直径，在培养的第3天测定，结果见表4.不同碳、氮源对菌株HZ-1生长影响的方差分析结果可以看出(表4)，碳源方面，麦麸培养基上菌落直径生长最快，高于对照及其他处理，玉米粉、葡萄糖及小麦粉次之，可溶性淀粉、蔗糖2种碳源对菌株生长无促进作用.其中，葡萄糖、玉米粉和小麦粉处理间不存在显著差异，其余处理间均存在显著性差异.因此，选取麦麸作为碳源；氮源方面，大豆粉、硫酸铵和酒糟处理后菌株生长较对照缓慢，这3种氮源对菌株生长无促进作用；尿素完全抑制菌丝生长，菌落直径为0，蛋白胨、酵母浸粉和硝酸钠处理培养基上菌丝菌落生长较好，其产孢量高，与其他处理比较差异显著.试验选取蛋白胨为氮源进行下一步研究.

表4 HZ-1在不同碳氮源培养基上的菌落直径比较

小写字母表示差异显著性(P<0.05)，大写字母表示差异显著性(P<0.01).

Lowercase letters represent the significance of difference at the level ofF0.05and uppercase letters represent the significance of difference at the level ofF0.01.

图2 HZ-1菌株在麦麸基质上的生长情况Figure 2 Growth of HZ-1 strain on wheat bran matrix

碳源可溶性淀粉、麦麸、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麦粉.Carbon soyuce：amylogen,wheat bran,saccharose,amylaceum,corn meal,wheat meal.图3 HZ-1在6种碳源培养基上生长情况Figure 3 HZ-1 growth on 6 carbon source media

氮源硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、酵母浸粉.Nitrogen source：NH4)2SO4,NaNO3,peptone,yeast powder.图4 HZ-1在4种氮源培养基上生长情况Figure 4 Growth of hz-1 on four nitrogen source media

2.3 最佳培养条件的确定

对菌株HZ-1固液发酵正交试验结果见表5.菌株HZ-1固态发酵统计分析结果见表6.7种因素极差R值从大到小依次是：培养温度(3.25)、培养时间(2.71)、N源(2.52)、初始含水量(1.27)、C源(1.26)、初始PH值(1.2)、接种量(1.06).因此，影响菌株HZ-1固态发酵条件的因素作用由大到小依次为：培养温度>培养时间>N源>初始含水量>C源>初始PH值>接种量.从各水平的统计A值比较来看，适合菌株HZ-1固态发酵的最佳条件为：N源蛋白胨50 mg/g、C源麦麸40 mg/g、培养基初始含水量300 mg/g、接种量0.3 mL/g、初始pH 7.4、最佳培养时间216 h和培养温度24.3 ℃.

表5 菌株HZ-1固态发酵含孢量的正交试验直观分析表

表6 菌株HZ-1 固态发酵菌粉含孢量的正交试验结果

Ai表示同一列中编号为i的所有指标试验结果之和.

Airepresents the sum of test results of all indexes numberediin the same column.

硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、酵母浸粉.(NH4)2SO4,NaNO3,peptone,yeast powder.图5 正交试验确定菌株HZ-1培养条件Figure 5 Orthogonal test to determine the culture conditions of HZ-1

3 讨论

菌株HZ-1是从青海省独特的气候及生态条件下筛选出来的，具有较强的除草活性，且安全性高，环境兼容性好[1].本研究通过固态发酵基质及碳氮源筛选，菌株培养条件的优化，确定了该菌株发酵的各项工艺参数指标.

研究微生物发酵所需的培养基配方和发酵条件是提高产孢量的一条途径和思路[9-12].对于生防菌株而言，发酵培养基的营养成分和发酵条件直接影响菌株的生长、代谢产物的调控，进而影响生物活性的强弱[13-15].生防菌株具有不同的发酵特性和营养需求，最适发酵条件和发酵培养基组分差异较大[16-17].研究表明HZ-1最适碳源为麦麸，最适氮源为蛋白胨.筛选出的最适产孢固态基质麦麸，适用于大批量生产，方便菌剂储存和运输[18-20].微生物发酵受多种生物和非生物因子的影响，碳氮源、基质含水量、接种量、初始pH、培养时间、培养温度等因素是发酵过程中极为关键的控制和检测参数，可直接影响到菌体生长和产物合成[21-25].通过正交试验筛选出菌株HZ-1最佳培养基含水量、最适接种量、最适温度、最适发酵时间.对于菌株HZ-1的发酵生产工艺来说，明确各因素与菌株发酵生产之间的关系，得到最优的发酵参数，将为该菌的剂型研究和规模化生产提供理论依据和技术参考.

本研究只在实验室里对极细链格孢HZ-1培养基的组成及其培养条件进行了优化.优化后的发酵培养配方可为下一步中试生产提供技术支撑，但优化后的配方和发酵条件是否符合大规模工业化生产还需进行大体积发酵罐实际验证.

4 结论

本研究确定了除草活性菌株HZ-1固态发酵基质、最适碳氮源和固-液发酵条件.单因素试验筛选出该菌株最佳产孢的固态基质为麦麸，最适碳源为麦麸，最适氮源为蛋白胨(50 mg/g).正交优化试验得出该菌最适固-液发酵条件为：蛋白胨50 mg/g，麦麸40 mg/g，培养基初始含水量300 mg/g，适宜的接种量0.3 mL/g，初始pH值7.4，最适温度24.3 ℃，发酵最适时间为216 h.