猪皮中胶原蛋白的提取

林 琳，牛一帆，史振霞，尚校兰，路彦霞，高瑞寒，王碧柔

（廊坊师范学院,河北 廊坊 065000）

0 引言

随着生活水平的日益提高，人们对肉类的消费需求不断上涨，尤其是猪肉。猪皮占胴体的10%，猪皮中含有大量蛋白质，是猪肉的2.5 倍之多，但是脂肪含量却不足它的50%［1,2］。猪皮里面的主要成分是胶原蛋白，占蛋白质总含量的87.7%左右［3］。猪皮中的胶原蛋白可以使人的皮肤变得水润柔滑、有弹性，可延缓衰老，预防癌症和骨质疏松［4］。除此之外，有研究发现，胶原蛋白对预防近视也有一定的作用［5］。研究猪皮中胶原蛋白提取，可以充分发挥猪皮的营养价值，创造更大的经济效益。目前，水解猪皮的方法主要包括酸法水解［6］、碱法水解［7］、氧化法水解［8］、酶法水解［9］以及混合法水解［10］。本研究采取酸法水解，操作简单易行。

目前，国内报道多侧重于研究猪皮中胶原蛋白的功能特性，而对于胶原蛋白的提取方法及提取率优化方面的研究鲜见报道。本研究通过正交试验确定了猪皮中胶原蛋白提取的最佳条件，并对其纯度进行测定，确定提取率最高的试验条件，为胶原蛋白提取方法的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪皮（购于超市），对二甲氨基苯甲醛（分析纯，天津市化学试剂一厂）；醋酸钠（分析纯，天津市化学试剂一厂）；异丙醇（分析纯，天津市化学试剂一厂）；冰醋酸（分析纯，天津市化学试剂三厂）；硫酸氢钠（分析纯，天津市化学试剂三厂）；羟脯氨酸标准品（北京索莱宝科技有限公司）；氯胺T（分析纯，天津市光复试剂有限公司）；正丙醇（分析纯，天津市光复试剂有限公司）；高氯酸（分析纯，天津市光复试剂有限公司）

1.2 仪器与设备

电子天平（JA21002 型）：上海精密科学仪器有限公司；紫外可见光分光光度计（22PC0314 型）：上海棱光技术有限公司；冷冻干燥机（Christ ALPHA 1-2）：上海甄明科学仪器有限公司；pH 计（ST3100/F）：奥豪斯仪器常州有限公司；电热恒温水浴锅（HH-4型）：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 胶原蛋白提取

1.3.1 新鲜猪皮的处理

新鲜猪皮，刮去猪毛，去掉污物，60℃左右的热水中洗涤3次，用刀去除皮下脂肪，将处理之后的猪皮切成1×1cm 的条状，4℃保存。每份猪皮称量5g，放入锥形瓶中待用。

1.3.2 样品脱脂

脱脂液配制：配制2.5%，5.0%，7.5%，10%，12.5% 的脱脂液，分别称取2.5g，5.0g，7.5g，10g，12.5g 的Na2CO3，蒸馏水溶解后，容量瓶定容至100mL。

脱脂时，每份样品加入20mL 的蒸馏水，再加入以上5 种脱脂液，充分搅拌10min，过滤，按上述步骤再重复一次，清水漂洗两次。每组实验做三组平行。

1.3.3 盐处理

盐溶液配制：取2.25g NaCl，蒸馏水溶解，定容至250mL。

样品盐处理条件参照蓝蔚青实验方法［12］。

每份猪皮加8.3mL 等渗盐水，放入恒温水浴锅内，在60℃的条件下分别水浴0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，期间不断搅拌，使猪皮受热均匀，用40℃的蒸馏水漂洗两次。每组实验做三组平行。

1.3.4 酸处理

样品酸处理条件参照梁权实验方法［13］。

36%醋酸溶液：36.18mL 冰醋酸，蒸馏水定容至100mL。

NaHSO3溶液：4g NaHSO3溶解于125mL 蒸馏水中。

用pH 计分别调配pH 为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 的醋酸缓冲液。

分别用以上5种不同pH值的醋酸缓冲液8.3mL对猪皮进行处理，放入60℃恒温水浴锅中水浴1.5h，期间不断搅拌，使猪皮受热均匀，用40℃蒸馏水漂洗两次。每组实验做三组平行。

1.3.5 冻干

将经过处理的猪皮放入冰箱预冷冻3-4h，放入冷冻干燥机-80℃冷冻干燥12 小时以上，取出。粉碎、称重。

1.4 胶原蛋白纯度测定（羟脯氨酸含量的测定）

1.4.1 试剂的配制

①柠檬酸缓冲液（pH6.8）：将14.0g 氢氧化钠、26.0g柠檬酸和78.0g醋酸钠溶解于500mL的蒸馏水中，转移至1000mL 容量瓶，加入250mL 正丙醇，用蒸馏水定容，存于棕色瓶中，置于阴凉通风处。

②氯胺T 试剂：将1.41g 氯胺T 溶解于上述柠檬酸缓冲液。

③显色剂：量取35.0mL 60%的高氯酸，加入10.0g 对二氨基苯甲醛，缓慢加入65.0mL 异丙醇（该试剂调配后立即用掉）。

④羟脯氨酸标准工作液（5μg/mL）：羟脯胺酸标准品5.0mg，蒸馏水定容至1000mL。

1.4.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制

从猪皮中提取的胶原蛋白多为I型胶原蛋白，含大量的羟脯氨酸。本实验通过测定羟脯氨酸含量，乘以系数（9.75）即可得到胶原蛋白的含量［14-15］。

配制浓度为0.5，1.0，1.5，2.0μg/mL 的标准溶液。分别取10.0、20.0、30.0与40.0mL的羟脯氨酸标准工作液于100mL的容量瓶中，蒸馏水定容。

准备具塞试管，取上述不同浓度的标准工作液4mL 于试管中，加入2mL 氯胺T 溶液，混匀，室温静置20min，加入2mL 对二氨基苯甲醛试剂，摇匀后立刻放入60℃的水浴锅中，20min 后取出，冷水冲洗3min以上，放置在室温下，30min后用紫外分光光度计测定吸光度，波长为558nm±2nm，绘制出标准曲线。以蒸馏水为空白对照。

1.4.3 羟脯氨酸含量测定

称取4g胶原蛋白提取物放入锥形瓶中，用配制好的硫酸溶液在105℃的条件下对其进行水解，水解时间16h。用滤纸将水解液过滤至250mL 容量瓶中，蒸馏水定容。吸取4mL 标准工作液到试管中，根据测出的吸光度算出羟脯氨酸的浓度。按照公式（1）计算出样品中的羟脯氨酸含量。

式中:W-提取物的羟脯氨酸含量，mg/g；C-标准曲线上对应的羟脯氨酸浓度，μg/mL；m-称取样品的质量，g；f-稀释倍数。

1.5 正交试验设计

以胶原蛋白得率为评价指标，根据单因素试验结果，对脱脂液浓度、盐析时间以及酸处理pH 进行三因素三水平正交试验，通过正交试验确定胶原蛋白最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 脱脂液浓度单因素试验

脱脂液浓度单因素实验结果如图1所示。由图1 可知，当脱脂液浓度为5.0%时，胶原蛋白提取物质量最大，为1.493g，故选取2.5%，5.0%，7.5%脱脂液浓度进行正交试验。

图1 脱脂液浓度对胶原蛋白提取物质量影响

2.1.2 盐析时间单因素试验

盐析时间单因素试验结果如图2 所示。由图2 可知，随着盐析时间的增加，胶原蛋白提取物质量随之降低。当盐析时间为0.5h，1.0h，1.5h 时，胶原蛋白提取物质量较大，分别为1.553g，1.440g，1.320g。但考虑盐析时间过短，脂肪物质溶解不充分，故正交试验中盐析时间确定为1.0h，1.5h，2.0h。

图2 盐析时间对胶原蛋白提取物质量影响

2.1.3 酸处理pH单因素试验

酸处理pH 试验结果显示，当pH 为4.0 时，胶原蛋白提取物质量最高，为1.33g，故选取pH3.5，4.0，4.5进行正交试验。

2.1.4 正交试验结果

正交试验（L（933））因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

由极差分析可得，三个因素对胶原蛋白提取率的影响大小依次为盐析时间＞pH＞脱脂液浓度，最终确定的优化条件是盐析时间1.5h，pH 3.5，脱脂液浓度5%，此时，5g 猪皮胶原蛋白提取量为2.16g，得率为43.2%。

2.2 羟脯胺酸标准曲线的绘制

根据羟脯胺酸标准品浓度与吸光度绘制标准曲线，其线性回归方程为：y=0.1728x+0.0026，其中x为羟脯氨酸浓度，y 为吸光度，相关系数R2=0.9992，表明相关性良好。标准曲线如图3所示。

图3 羟脯氨酸标准曲线

2.3 胶原蛋白提取物纯度测定

按照1.4.3 中的方法测定最优提取条件下胶原蛋白提取物纯度。当提取条件定为：盐析时间1.5h，pH 3.5，脱脂液浓度5%，提取物吸光度为0.154，胶原蛋白纯度为85.44%。

3 结论

本研究主要对猪皮中胶原蛋白提取条件进行优化。通过单因素试验及正交试验确定胶原蛋白最优的提取条件：盐析时间1.5h，pH 3.5，脱脂液浓度5%；同时，利用分光光度计测定出该条件下胶原蛋白的纯度为85.44%。本研究可为合理利用猪皮及工业化生产胶原蛋白提供理论依据。