警犬狂犬病血清中和抗体调查

杜晓鹏 毛爱国 徐 陶 王翠萍 谢宝泽 张明飞 王 雄 党西锋 卓丙德 蒋辉军 朱文静 张俊森

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的一种致死性人兽共患病，病死率几乎高达100%。目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法，及时接种疫苗是预防狂犬病的最有效措施之一。

全世界所有报告的动物狂犬病病例中约有95%是在犬，超过90%的人死亡归因于狂犬病犬，大规模疫苗接种是犬狂犬病防治的主要方法。犬的狂犬病免疫覆盖率低于70%是诱发人间狂犬病发生的主要原因，2017年全国共报告502例人狂犬病死亡病例，狂犬病疫情呈整体下降趋势，但是我国西南地区的广西、云南、四川和贵州四省依然是我国人和动物狂犬病高发省份，仅华南地区的海南省为我国低发省份。

为了解我国南方地区的警犬狂犬病疫苗免疫效果，分析影响警犬免疫合格率的因素，2017～2018年对西南地区狂犬病高发省份广西、云南、四川和贵州，以及华南地区低发省份海南省五省部分地区警犬狂犬病血清中和抗体进行调查，随机抽样342头警犬，有效样本342份，采用荧光抗体病毒中和试验（FAVN），检测血清中RABV血清中和抗体效价。

一、调查对象

根据抽样地区警犬工作布局情况，选取云南、贵州、四川、广西、海南五省部分地区进行抽样。按照7月龄以上训练犬与工作犬总数量的10%进行抽样：每个性别组按照10%的比例进行间隔抽样；当超过20头时，可按照隔2抽1、隔3抽1的原则抽样，以此类推。共选取警犬342头，为训练犬和工作犬，身体健康。

（一）范围

云南选取昆明、楚雄某训练场56头警犬，贵州选取贵阳某训练场60头警犬，四川选取成都、绵阳、德阳、泸州四个训练场71头警犬，广西选取南宁、桂林、梧州、玉林93头警犬，海南选取海口、三亚、万宁、陵水、保亭、瞻洲、澄迈等62头警犬，总共342头。

（二）警犬免疫程序与免疫覆盖率

1. 警犬免疫程序 3月龄时进行1次狂犬病灭活疫苗注射，以后每年注射1次；1岁以上的犬，每年进行1次狂犬病灭活疫苗注射。5个省（区）都对辖区单位开展警犬训练培训工作，幼犬在6月龄左右进行训练，3～6月后训练结束，由上述训练单位调至新的工作单位，狂犬病免疫程序并入新单位的年度免疫。

疫苗：云南、贵州选用疫苗为A品牌（Pasteur RIV株，至少2IU），定义为A组；四川选用B品牌（HCP-SAD株，灭活前不少于106.3FAID50/mL），定义为B组；南宁、桂林、玉林均使用A疫苗；梧州使用A疫苗、B疫苗和C疫苗（Rb/E3株≥105.0LD50/0.03ml）、D疫苗（G52株，每头份至少为1IU），后两种疫苗分别定义为C组、D组。

2. 经查阅档案调查，南方5省的警犬狂犬病疫苗免疫覆盖率为100%。

（三） 检测犬种 包括德国牧羊犬、马里努阿犬、昆明犬、罗威纳犬、拉布拉多犬、史宾格犬、寻血猎犬、维兹拉犬与昆马杂交犬，按照中国工作犬管理协会的犬种分组表，将检测犬分为大型犬（55cm以上）、中型犬（35.1-54.9cm）与小型犬（35cm以下）。本研究中德国牧羊犬、马里努阿犬、昆明犬、罗威纳犬、寻血猎犬与昆马杂交犬属于大型犬，拉布拉多犬、史宾格犬与维兹拉犬属于中型犬。

（四） 采样 2016～2018年完成南方5省的警犬采样工作，检测犬覆盖了上述地区所有训练犬与工作犬，检测犬的采样时间为最近一次免疫后28天的各个时间段，所有数据均为横断面采集。

二、 材料与方法

（一）待检血清：在警犬狂犬病灭活疫苗免疫后28天，从待检犬前肢头静脉采血至少3mL，静置2小时，1500rmp/min离心30min，分离血清，冷冻保存或冷链运输至实验室，备用。出现溶血需重新采取血样并分离血清。

（二）检测试剂

1.标准血清：购自法国欧盟狂犬病血清学参考实验室，效价为5.92IU/mL。

2. 阴性血清：采集自未免疫健康犬，由军事兽医研究所世界动物卫生组织（OIE）狂犬病参考实验制备。

3.荧光抗体：FITC荧光素标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体购自Fujiribio公司。

4. 狂犬病病毒CVS-11细胞毒：军事兽医研究所保存，滴度为106.67TCID50/mL。

（三）检测方法

1. 样本处理：待检血清分别在56℃灭活30min。

2. 检测：采用OIE《陆生动物诊断测试和免疫手册》2013版直接免疫荧光病毒中和试验（FAVN）对待检血清中RABV中和抗体效价进行检测。首先对标准血清和待检血清进行3倍梯度稀释，稀释区域第1列各孔内预先加入100µL培养液，每孔加入血清50µL，混匀后吸取50µL加入第2列，依此稀释。取预先确定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培养液稀释至30-300TCID50/50µL，除细胞及培养液对照孔外每孔加入50µL，置37℃中和60min。BHK-21细胞经胰酶消化、分散、计数，稀释至4×105/mL，除培养液对照孔外每孔加入50µL细胞悬液，于37℃5%CO2培养箱培养48h。弃细胞培养上清，加入50µL冷丙酮-20℃固定细胞1h，PBST洗涤后，将狂犬病病毒核蛋白荧光抗体稀释至工作浓度，每孔加入50µL工作液，37℃孵育1h。PBST洗涤，荧光显微镜下观察每个孔，孔内有荧光细胞即记为感染，为阳性；无荧光细胞为完全中和，为阴性。基于Spearman-Karber公式的推导公式计算待检血清RABV中和效价。

以犬免疫后血清RABV中和抗体效价≥0.50IU/mL为阳性标准，达到或超过0.50IU/mL即具有效保护水平。

（四）统计学分析

检测数据采用SPSS18.0及Excel2007进行分析处理。

表1 342头警犬RABV中和抗体检效价检测结果

表2 不同年龄的警犬RABV中和抗体效价检测结果

表3 不同免疫次数的警犬RABV中和抗体效价检测结果

三、结果与分析

（一） 342头警犬RABV中和抗体效价检测结果，见表1。342头警犬中和抗体阳性230头，整体免疫合格率为67.25%。其中，四川地区免疫合格率最高，为76.06%；云南最低，为57.14%。分析显示：四川的免疫合格率与云南、广西、贵州3个地区免疫合格率之间差异显著（P＜0.05），与海南之间差异不显著。

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗体效价检测结果 单位：份

表5 不同体型的警犬RABV中和抗体效价检测结果

表6 不同性别的警犬RABV中和效价检测结果

（二） 不同年龄的警犬RABV中和抗体效价检测结果，见表2。将342头警犬分成3～6月龄犬、7～12月龄、13～24月龄、2～6岁、6岁以上5个年龄组，各个年龄段的免疫合格率分别为56.14%、39.13%、68.42%、76.80%、78.95%。分析表明：1岁以上的犬免疫合格率明显高于1岁以下犬，它们之间差异极显著（P＜0.01）；7～12月龄犬的免疫合格率明显低于其他年龄段的犬，差异极显著（P＜0.01）。

（三） 不同免疫次数的警犬RABV中和抗体效价检测结果，见表3。对342头警犬，按照不同的免疫次数进行分组，数据显示：免疫1次以上的警犬免疫合格率明显高于免疫1次的警犬，免疫1次的警犬合格率仅为49.60%。分析显示，免疫1次的免疫合格率与免疫2～3次之间差异极显著（P＜0.01），免疫1次的免疫合格率与免疫4次及4次以上之间差异极显著（P＜0.01）。

（四） 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗体效价检测结果，见表4。结果显示：云南、贵州、广西和海南大多选用A组疫苗，四川选用B组疫苗；广西梧州个别单用选用C组与D组疫苗，警犬数量分别为2头与1头，不具有统计学意义，对于C组与D组疫苗的免疫效果不做分析。分析发现：云南、贵州、广西和海南使用的A组疫苗，免疫合格率为65.53%，四川选用的B组疫苗免疫，合格率为76.06%，高于云南、贵州、广西和海南的免疫效果，A组疫苗和B组疫苗之间差异显著（P＜0.05）。

（五） 不同体型犬种的警犬RABV中和抗体效价检测结果，见表5。本次检测警犬为中型犬和大型犬，从结果看出：中型犬的免疫合格率为65.12%，大型犬的免疫合格率为67.97%，两者之间差异不显著（P＞0.05），说明在中型犬与大型犬中，体型大小对免疫合格率无影响。

（六） 不同性别的警犬RABV中和抗体效价检测结果，见表6。结果显示：检测的公犬与母犬，其免疫合格率为67.37%（128/190），母犬的合格率为67.11%（102/152），两者之间没有差异，说明警犬的性别对狂犬病疫苗免疫合格率没有影响。

（七） 不同采样时间的警犬RABV中和抗体效价检测结果。342头警犬的采样时间分别为最后一次免疫后的14d、34d、60d、90d、120d、180d、270d、300d、330d和360d，其免疫合格率见表7。在免疫后14d内采样，其免疫合格率可以达到92.86%（13/14）；而在免疫后90d采样，其免疫合格率将出现下降，说明在免疫后90d，血清中和抗体将出现下降趋势。

表7 不同采样时间的警犬RABV中和效价检测结果

四、 讨论

（一）本次检测通过横断面数据分析云南、贵州、四川、广西和海南五省部分地区警犬的RABV中和抗体水平，342头检测警犬，阳性230份，免疫合格率为67.25%。说明警犬的狂犬病疫苗免疫效果无法达到100%的保护作用，需加强南方五省警犬狂犬病疫苗接种工作。

（二） 在我国狂犬病高发省份与低发省份，按照现行的警犬狂犬病疫苗免疫程序，其免疫合格率接近，没有出现与国内狂犬病疫情流行相似的规律。说明对犬进行狂犬病疫苗接种，可保证犬的免疫合格率，应继续加强对警犬的狂犬病疫苗接种工作。

（三） 警犬的免疫合格率与年龄成正相关。本次检测1岁以下的警犬免疫合格率39.13～56.14%，1岁以上的均超过70%。这与Kennedy等人的研究结果相同，年龄较小的犬由于免疫系统不健全，接种疫苗的效果较差。

（四） 警犬的免疫合格率与免疫次数密切相关。本次检测将免疫次数分为免疫1次、免疫2～3次、免疫4次及以上3个组别，其免疫合格率分别为49.60%、78.49%、77.05%。数据显示：免疫2次及以上的警犬免疫合格率明显高于免疫1次（P＜0.01），说明免疫次数越多，免疫合格率越高。Tk S的调查显示，连续多次接种狂犬病疫苗的犬比只接种1次疫苗的犬具有更好的抗体滴度。

（五）对于大型犬与中型犬，警犬的体型大小对免疫合格率影响不大。本次检测中，没有出现小型犬，检测的大型犬与中型犬的免疫合格率分别为67.97%、65.12%，两者之间差异不显著；检测犬种仅出现1头杂交犬（大型犬），其检测结果不具备统计学意义。据Berndtsson LT等人报道，中大型纯种犬免疫效果不如小型犬或杂交犬，体型较小的犬比体型较大的犬能产生更高的抗体水平。这可能的原因是相同剂量的疫苗，体型越小，抗体反应就越强。

（六）警犬的性别对免疫合格率没有影响。本次检测结果与Mansfield KL等人、JAKEL等人的研究结果一致，说明犬的性别对抗体应答没有影响。

（七） 不同种类的疫苗种对免疫合格率有影响。不同种类疫苗，免疫合格率之间存在差异，这是否与疫苗毒株型，以及抗原含量、所用佐剂的浓度和完整性有关，需要进一步实验验证。

（八） 不同采样时间对免疫合格率的影响。本次横断面的数据显示，在免疫后不同时间采样，免疫合格率存在明显差异。免疫后14d内采样，其免疫合格率可达92.86%，而在免疫后90d采样，免疫合格率将出现下降趋势。Kennedy 报道了在免疫后30d采样，免疫合格率最高，随着采样时间的延续，未达到抗体应答点的犬的比例也在增加。据报道，FAVN的最高通过率出现在犬接种后1～4周，这与本次检测结果相似。

（九） 免疫失败是导致免疫合格率低的重要原因。本次检测中，某警犬训练单位的10头3～7岁的全部检测警犬，检测结果均低于0.50IU/mL，这对整个抽检地区的检测结果造成影响。有研究证明：犬的中和抗体水平与免疫次数成正比，免疫次数越多，抗体水平越高。按照规定的警犬免疫程序至少有3～7次的狂犬病疫苗接种史，结果不应该全部不合格。低水平的不合格检测结果说明：该单位过去几年的狂犬病免疫属于免疫失败，应查找原因，尽快加强狂犬病疫苗接种。

五、 结论与建议

（一） 本次横断面数据分析显示，我国南方五省警犬狂犬病防控工作存在不足，应加强狂犬病疫苗接种工作，杜绝免疫失败；狂犬病高发省份与低发省份的警犬狂犬病防控工作，没有出现与国内狂犬病疫情流行相似的规律。警犬的免疫合格率与年龄成正相关，与免疫次数关系密切，免疫次数越多，免疫合格率越高；警犬的免疫合格率与采样时间、疫苗种类有关，与犬的性别没有关系；对于大型犬和中型犬，体型大小对免疫合格率影响不大。

（二） 随着警犬社会化训养工作的加强和“民犬警用”工作的延伸，应从警犬的“入口”加强狂犬病防控工作。据我们对云南某犬场社会化训养区域农户家养犬及散养犬、流浪犬的监测，其血清中和抗体水平合格的不足20%，若该区域有狂犬病野毒存在，将威胁社会化训养区域的警犬。

（三） 完善《警犬疾病防治工作规则》。其中规定“警犬3月龄时进行1次狂犬病灭活疫苗注射，以后每年注射1次”。本次调查，警犬在12月龄前免疫合格率普遍偏低，尤其是7～12月龄的警犬。作者在“云南某犬场犬狂犬病灭活疫苗免疫抗体效价评估”中，同样发现12月龄以下警犬免疫合格率仅为9.68%。建议规则修改为“警犬3月龄时进行第1次狂犬病灭活疫苗注射，28天后进行第2次狂犬病灭活疫苗免疫，以后每年注射1次”。

（四） 规范警犬狂犬病灭活疫苗免疫工作，严格执行公安部颁发的《警犬疾病防治工作规则》，包括疫苗的采购、运输、保存及注射工作。

（五） 加强带犬人员狂犬病的预防和保护工作，对每个新从业人员进行狂犬病防护知识培训。

（六） 有条件的单位可以开展警犬狂犬病灭活疫苗免疫效果监测工作，监测方法包括：狂犬病抗体测试板、ELISA检测法、荧光抗体病毒中和试验（FAVN）等。