响应面法优化植物乳杆菌发酵混合蔬菜汁

樊龙星，张朝正，赵华

(天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457)

紫甘蓝原产于地中海沿岸，因其环境适应能力强，现引入中国大范围种植。它含有丰富的营养成分，因此具有多种保健功效。它具有抗氧化性[1-4]、维护肝脏[5,6]、提高记忆力[7]、抑菌、抗病毒抗癌、抗肿瘤等功效[8-13]。胡萝卜也具有很高的营养价值、它具有调节人体免疫力、提高繁殖能力和促进人体生长发育等作用[14]。西红柿成分丰富，功效多样，具有降胆固醇、降低血脂、抗癌、抗肿瘤、降血压等疗效[15-17]。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，属于革兰氏阳性菌株，是一类菌体具有弯杆状、圆端短杆状和链状3种形态，且不产芽孢的兼性乳酸菌[18]。它可以利用葡萄糖、果糖、乳糖和木糖等作为原料进行代谢生长而产酸。其常见于泡菜[19]、酵素和酸奶等发酵的食品中，可以有效改善肠胃环境。

本文以紫甘蓝、胡萝卜和西红柿为培养基进行植物乳杆菌的发酵产酸。以总酸为指标进行单因素实验和响应面实验，对植物乳杆菌的发酵条件进行优化，为之后的饮料配制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)：由泡菜中经筛选、分离、鉴定所得。

1.1.2 材料

紫甘蓝、胡萝卜、西红柿：天津滨海新区市售。

1.1.3 仪器设备

EX125DZH电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司；Centrifuge 5418微量离心机 德国Eppendorf公司；ZWER-D2401控温摇床 上海智能分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总酸测定

采用指示剂法检测样品中的总酸含量[20]，量取50 mL待测样品于250 mL锥形瓶中，加入2滴酚酞指示剂。总酸含量的计算方法如下：

式中：X为样品中总酸含量(以乙酸计)，g/L；C为标准滴定氢氧化钠溶液实际浓度，mol/L；V1为吸取滴定样品的体积，mL；V2为滴定消耗的氢氧化钠溶液的体积，mL；60为乙酸摩尔质量数值，g/mol。

1.2.2 蔬菜汁配比的确定

将新鲜蔬菜处理后，按照料液比为1∶2的比例进行破壁，制作蔬菜汁，并按照不同的配比混合，紫甘蓝汁∶西红柿汁∶胡萝卜汁为1∶1∶1、2∶1∶1、3∶2∶1、5∶2∶1、5∶3∶1、6∶3∶1、6∶4∶1。将混合蔬菜汁在85 ℃下灭菌15 min，待冷却至30～35 ℃时，接入3%的植物乳杆菌的种子培养基，再发酵36 h。以植物乳杆菌发酵后的感官评价为指标，确定3种蔬菜的最佳配比。

主要施工流程：新托架制作→挂设吊篮→定位钻孔→清孔→锚固螺栓→安装新托架→扶正并焊接原托架→拆除吊篮→恢复原状。

1.2.3 单因素实验

以总酸含量为指标，分别以接种量(1%、2%、3%、4%、5%)、发酵温度(25，30，35，40，45 ℃)和发酵时间(24，36，48，60，72 h)为影响因素，利用单因素实验确定各因素的最佳实验水平，为响应面优化奠定了基础。

1.2.4 响应面实验

通过单因素实验初步确定接种量、发酵温度和发酵时间对总酸产量的影响。利用Box-Behnken进行实验设计，试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken实验因素与水平Table 1 Experiential factors and levels for Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 蔬菜汁配比的确定

以不同比例的3种蔬菜汁配制植物乳杆菌培养基的方案以及感官评分见表2。

表2 蔬菜汁比例和感官评分Table 2 Vegetable juice ratios and sensory scores

由表2可知，植物乳杆菌的最佳配比培养基为6∶3∶1，当为此比例时，发酵后的感官评分最高，可达到74.37分，主要由于发酵后此产品香气愉悦突出，颜色鲜艳，而且口感酸爽适宜。

2.2 蔬菜汁发酵条件的确定

2.2.1 接种量对发酵作用的影响

将接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%的蔬菜汁培养基，在35 ℃下摇床培养48 h，取部分发酵液离心过滤后，取上清液进行总酸检测，实验结果见图1。

图1 接种量对总酸产量的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on total acid production

2.2.2 温度对发酵作用的影响

接种4%的种子液于蔬菜汁培养基中，分别在25，30，35，40，45 ℃的条件下发酵48 h，将发酵液离心过滤，取上清液检测总酸含量，实验结果见图2。

图2 温度对总酸产量的影响Fig.2 Effect of temperature on total acid production

由图2可知，随着温度的升高，总酸含量出现先上升后下降的趋势。温度适合微生物代谢生长时，其代谢活动旺盛，总酸可得到积累。而温度过高或者过低时，不适合微生物生长，都会影响总酸的产量。由图2可知，35 ℃时总酸含量最高，即35 ℃为最佳发酵温度。

2.2.3 发酵时间对发酵作用的影响

接种4%的种子液于蔬菜汁培养基中，在35 ℃的温度下，分别发酵36，48，60，72，84 h，将发酵液离心过滤，取上清液检测总酸含量，实验结果见图3。

图3 发酵时间对总酸产量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on total acid production

由图3可知，随着发酵时间的不断延长，总酸含量在不断增加。当发酵时间为72 h时，总酸的含量达到11.87 g/L。当发酵时间为84 h时，总酸含量达到11.92 g/L，仅增长了0.42%。因此，选择最佳发酵时间为72 h。

2.2.4 响应面实验

结合以上单因素实验结果，使用Design-Expert 10.0软件对蔬菜汁发酵工艺进行响应面设计优化，以总酸产量为指标，实验设计与结果见表3。

表3 响应面实验的设计与结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

对表3进行回归分析，得到的回归方程为：

Y=-48.779+5.296X1+2.171X2+0.250X3+0.090X1X2-1.146×10-3X1X3-7.083×10-4X2X3-1.019 X12-0.034X22-1.395×10-3X32。

该回归模型的方差分析和可信度分析结果见表4。

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

注：P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

由软件Design-Expert 10.0拟合的方程可知，所有二次项前的符号皆为负数，即抛物线的开口向下，因此理论上应存在极大值点。由方差分析表4可知，模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.0653>0.05)，表明回归方程拟合良好。且模型R2=0.9938，调整后的R2=0.9827，表明模型99.38%的变化均来源于自变量，实验值与模型预测值接近，误差较小，可用于本实验总酸含量的分析与预测。且变异系数C.V.=1.24%，证明该实验较稳定。

由表4可知，各因素均对总酸产量具有一定的影响。其中，X1(接种量)、X2(温度)、X3(发酵时间)、X12、X22和X32对总酸的产量具有极显著影响(P< 0.01)，且由F值可得，各因素对总酸产量影响的主次：为接种量>发酵时间>温度。在交互项中只有接种量(X1)和温度(X2)之间具有极其显著的交互作用(P=0.0007<0.01)，其他均不存在显著的交互作用。

综上所述，该模型可用于本实验的分析与预测，由此得出各因素相互作用的响应面分析图，见图4。

图4 各因素交互作用对总酸产量的影响Fig.4 Response surface plots and contour plots for the interaction effects of different factors on total acid production

各因素之间的交互作用对总酸产量的影响见图4，和方差分析的结果一致。使用软件Design-Expert 10.0，得到该模型的极大值点，即蔬菜汁的最佳发酵条件：接种量为4.164%，温度为35.886 ℃，发酵时间为77.108 h，得到最大总酸产量为11.244 g/L。考虑实际实验操作方便性，调整优化发酵条件：接种量为4.2%，温度为36 ℃，发酵时间为77 h，根据模型的回归方程预测总酸产量为11.242 g/L。利用优化后的实验条件进行3次验证实验，得到的总酸产量为11.238 g/L，与模型预测值接近，说明该模型可很好地预测总酸的产量。

3 结论

本文先确定以紫甘蓝∶胡萝卜∶西红柿为6∶3∶1的蔬菜汁比例为植物乳杆菌的培养基，再利用单因素实验确定接种量、温度和发酵时间分别对植物乳杆菌产酸的最优条件，并在此基础上，进行响应面实验，最终确定植物乳杆菌的最佳发酵产酸条件：接种量为4.2%，温度为36 ℃，发酵时间为77 h，此时模型预测值为11.242 g/L。最终经过验证表明，在此最优发酵条件的基础上产酸总量为11.238 g/L，与模型预测值相近，则此模型可用于预测植物乳杆菌的最佳发酵条件，为进一步配制饮料奠定了基础。