Y-trap结构的抗PD-1/VEGFR双功能融合蛋白的研制

刘庆友，何 芸，洪伟东，邹 敬，胡品良*

（ 1.北京比洋生物技术有限公司， 北京 100176；2.昆明市延安医院肾内科，云南 昆明 650051 ）

免疫检查点（immune checkpoint）是免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受[1]。程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）和其配体程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）的相互作用是发挥免疫检查点作用主要分子。肿瘤细胞正是利用这一重要机制抑制T淋巴细胞活性，达到逃避免疫系统对其攻击的目的。抑制PD-1/PD-L1抗体主要通过抑制PD-1与PD-L1的结合，促进T淋巴细胞增殖和细胞因子产生，解除PD-1/PD-L1系统对肿瘤活性T淋巴细胞免疫监视的抑制。临床实践证实PD-1/PD-L1抗体虽然有较好的治疗效果，但平均有效率仅为20-30%左右，有相当一部分患者对这类治疗无反应。如何提高免疫治疗的有效率是目前肿瘤治疗领域需要解决的难题之一。

研究表明血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGFs）也有参与肿瘤微环境，抑制肿瘤微环境中免疫细胞的作用。在治疗肿瘤的研究中发现，抗免疫检查点与血管生成拮抗药物有很高的协同效应[2]。

本研究通过分子生物学技术成功构建了一种Y-trap结构的抗PD-1抗体/VEGFR双功能融合蛋白：将PD-1抗体的轻链编码基因构建至双表达盒的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体，再将PD-1抗体重链编码基因3’端与VEGFR1的功能区Ⅱ（D2）和VEGFR2的功能区Ⅲ(D3)编码基因通过柔性片段(GS4)3编码基因连接。然后进行瞬时表达，收获培养液；经亲和层析纯化蛋白；最后检测蛋白结构、抗原抗体结合能力分析和体内抑瘤试验等研究。现将该研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

双表达盒的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体载体p327.7为北京比洋生物技术有限公司所有（专利授权号：CN104195173B），EcoRI、XhoI、XbaI和SalI内切酶购自英国NEB公司，脂质体Lipofectamine2000和无血清培养基CD CHO 培养基购自GIBCO公司，HiTrap MabSelect SuRe纯化柱为GE公司产品，293F细胞购自Invitrogen 公司。

1.2 表达载体构建

根据International Nonproprietary Name（INN）数据库中有关Nivolumab的氨基酸残基序列,连接肽（GS4）3和VEGFR-1的功能区Ⅱ（D2）和VEGFR2的功能区Ⅲ(D3)氨基酸残基，优化为适合在中国仓鼠卵巢癌细胞（CHO）中表达的编码基因序列，并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成编码基因。通过XhoI-EcoRI双酶切将轻链编码基因连接至表达载体p327.7；通过XbaI-SaII将重链编码基因克隆至已连接轻链编码基因的表达载体p327.7。载体测序验证正确后备用。所表达的双功能抗体命名为BY24.3。

同样将Nivolumab抗体的轻链和重链的编码基因，分别通过XhoI-EcoRI和XbaI-SaII双酶切构建Nivolumab的双表达盒表达载体，所表达的Nivolumab命名为BY18.1。

根据International Nonproprietary Name（INN）数据库中有关的aflibercept氨基酸残基序列数据，优化为适合在中国仓鼠卵巢癌细胞（CHO）中表达的编码基因序列，并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成编码基因序列，通过XbaISaII构建到p327.7表达载体中。所表达aflibercept的命名为301-8。

1.3 蛋白表达表达及纯化

293 F 细胞悬浮培养于无血清CD 293 培养液中，转染前离心更换新鲜培养基，细胞浓度调整为1×106细胞/ml。以100ml细胞为例，分别将表达质粒DNA 250µg和PEI（Sigma，Cat.No：408727） 500µg分别加入1ml 293培养液中混匀。室温静置8min。将PEI /DNA混悬液逐滴加入摇瓶中，轻轻混匀，置于5% CO2、37 ℃摇床培养（120 rpm）5天后收集培养上清。

1.4 表达蛋白的纯化

收集转染的上清，培养上清液用0.22μm滤膜过滤。用pH 7.4的PBS溶液平衡 HiTrap MabSelect SuRe 1ml 柱（GE产品, Cat. No：11-0034-93）10个床体积，流速为0.5ml/min；用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液（pH 3.0）洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。纯化蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，分析蛋白大小。

1.5 Biacore方法检测纯化蛋白与PD-1和VEGF -A的结合

采用氨基偶联的方法首先将抗人IgG 抗体固定于CM5芯片，然后依次捕获双特异抗体，再应用Biacore T100仪器检测蛋白与抗原PD-1(北京义翘神州生物技术有限公司产品，cat:10377-H08H)和VEGF-165(北京义翘神州生物技术有限公司产品，cat:11066-HNAH)的相互作用及亲和力。最后用BIAevaluation 4.1 software将数据进行曲线拟合，计算抗体亲和力。

1.6 人源化小鼠模型中的抑制肿瘤生长效果

该研究委托北京百奥赛图基因生物技术有限公司完成。将MC38结肠癌细胞5×105个/0.1 ml接种于雌性B-hPD-1人源化小鼠右侧前胁肋部皮下，待肿瘤生长到约108 mm3时按肿瘤体积随机分组，每组6只，共5组，分别为：溶剂对照组、BY24.3 (6.4 mg/kg)、301-8（aflibercept）（3.3 mg/kg）和 BY18.1（nivolumab） (5 mg/kg)，各组剂量以BY18.1（nivolumab）为标准，最终摩尔量一致。所有组给药途径均为腹腔注射，每三天给药1次，连续给药6次，末次给药6天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤称重、拍照。计算相对肿瘤抑制率（TGI）。

TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100(Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值， T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，V0：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)

2 结 果

2.1 表达载体构建

构建成功的BY24.3、BY18.1（nivolumab）和301-8（aflibercept）表达载体经由上海捷瑞生物工程有限公司进行测序，测序结果表明表达载体构建正确。为保证表达载体构建的正确性，大提质粒后，分别应用XbaI-SaII和XhoI-EcoRI双酶切再次验证表达载体的正确性。BY18.1（nivolumab）和BY24.3的轻链大小一致均为723bp，重链分别是1401和2058bp，301-8（aflibercept）为1365 bp。具体结果见图1。

图1 表达载体构建及重组质粒双酶切鉴定Fig 1 Construction of expression vector and double enzyme digestion of recombinant plasmid

2.2 蛋白表达及纯化

融合蛋白BY24.3的结构见图2，轻链为完整的PD-1抗体轻链，通过二硫键与PD-1抗体重链CH1相连接，VEGFR功能区通过(G4S)3Linker连接至PD-1抗体的C末端。BY24.3轻链分子量理论预测23 kDa，实际25 kDa左右，重链分子量理论预测72 kDa，实际80 kDa左右。PD-1抗体BY18.1（nivolumab）轻链分子量理论预测23 kDa，实际25 kDa左右，重链分子量理论预测48 kDa，实际50 kDa左右；VEGFR融合蛋白301-8（aflibercept）分子量理论预测49 kDa，实际62 kDa左右。因受抗体糖基化影响，上述融合蛋白实际分子量略高于理论预测。纯化后的各种蛋白还原SDS-PAGE电泳，见图3。

图2 双功能融合蛋白BY24.3结构示意图Fig 2 Schematic diagram of the construction and final assembly of the bifunctional fusion protein BY24.3

图3 电泳法分析各纯化的蛋白（还原电泳）Fig. 3 Electrophoretic analysis of the purified ptotiens(Reduced)

2.3 Biacore方法检测纯化蛋白与PD-1和VEGF -A的结合

从表1结果可以看出，BY24.3（抗PD-1/VEGFR融合蛋白）保持了BY18.1（nivolumab）抗体与PD-1的亲和性，并获得了与VEGF-A的结合能力。BY18.1（NIVOLUMAB）和BY24.3与PD-1的亲和力（KD）基本一致，说明抗PD-1抗体制备成VEGFR融合蛋白后亲和力未受影响。301-8（aflibercept）和BY24.3融合蛋白与VEGF-A的亲和力达分别到2.74×10-12M和9.59×10-12M。301-8（aflibercept）融合蛋白与VEGF-A亲和力要高于BY24.3融合蛋白，但均达到pM级别。

表1 各蛋白与VEGF-A和PD-1的亲和力Table 2. Affinity parameters for BY18.1（nivolumab）,BY24.3and 301-8（aflibercept） binding to Human VEGF-A or PD-1

2.4 对肿瘤生长的抑制

试验过程中，所有动物精神状态良好，无动物死亡。实验结束时（首次给药21天后），各组动物体重均出现增长，BY24.3、BY18.1（nivolumab）和301-8（aflibercept）组动物与溶剂对照组动物体重比较无显著性差异（P＞0.05），表明动物对BY24.3、BY18.1（nivolumab）和301-8（aflibercept）耐受良好。

实验结束时，溶剂对照组平均肿瘤体积为1 3 8 6± 170 mm3, 而BY24.3、BY18.1（nivolumab）和301-8（aflibercept）组平均肿瘤体积分别为452 ± 69、739± 128和1023 ±256 mm3， TGI%分别为73.3%、50.6%和 60.2%。BY18.1（nivolumab）、301-8（aflibercept）与溶剂对照组的肿瘤体积相比有显著差异(P＜0.05)，表明BY18.1（nivolumab）和301-8（aflibercept）在此药效模型上抑瘤作用明显。 BY24.3与溶剂对照组和BY18.1（nivolumab）、301-8（aflibercept）组肿瘤体积相比均有明显差异(P＜0.05)，表明BY24.3有明显的抑瘤作用，且高于BY18.1（nivolumab）和301-8（aflibercept）。结果见图4。

图4 BY24.3 ,BY18.1（nivolumab）和 301-8（aflibercept）蛋白对MC38小鼠结肠癌细胞生长的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of BY24.3 , BY18.1（nivolumab） and 301-8（aflibercept） on MC38 colon cancer cell in B-hPD-1 transgenic mice

3 讨 论

双特异抗体是指采用基因工程技术得到的可以结合两个抗原或抗原表位的抗体。双特异抗体实质是一种经基因工程产生的免疫融合蛋白。目前已有3个双特异性抗体上市：Catumaxomab、Emicizumab 和Blinatumomab。在结构方面，双特异抗体至少有近百种的构建技术或平台[3]，这些技术多是以两个抗体为基础来构建双特异抗体，采用这些技术构建得到的双特异抗体有各自的优势和缺陷：比如基因泰克Knobs-into-Holes异源二聚化技术会导致相当量的同源二聚存在[4-5]；雅培一直依赖的的双可变结构域 Ig(Dualvariable domains Ig,DVD-Ig)技术，内部可变结构域结合抗原的亲和力会降低近10倍甚至百倍，且分子量较大，近200 Kd，结合不同抗原（尤其是膜抗原）时依然有相互干扰现象，雅培利用DVD-Ig开发的IL-17/TNF-α双特异抗体ABT-122和ABBV-257因在临床试验中发现存在较高的抗双特异抗体（ADA）而失败[6-7]。

PD-1/PD-L1联合抗血管生成疗法的有效性可能基于：通过阻断VEGF的免疫抑制作用并促进T细胞在肿瘤组织中的浸润从而提高PD-1/PD-L1单抗的疗效。作用于VEGF靶点的药物可有效“调控”肿瘤新生血管的功能趋向正常，改善由于新生血管异常而导致的肿瘤组织免疫功能“荒漠化”, PD-1或PD-L1抗体与血管生成拮抗药物联合用于肿瘤治疗有极大的临床应用前景。在PD-L1抗体Atezolizumab与Bevacizumab（AVASTIN）的一项治疗晚期肾癌的II期临床研究（IMmotion150），研究发现PD-L1高表达的患者接受Atezolizumab与Bevacizumab双重疗法的患者，疾病恶化或死亡率下降了36%，优于单种疗法。PD-1联合乐伐替尼用于晚期肾癌患者一线治疗有效率83%，疾病控制率100%[8]。

Y-trap双特异抗体技术为约翰·霍普金斯大学Bedi教授等于2017年首次命名[9-10]。该双功能抗体由两部分组成，一部分是针对特定靶标的抗体，另一部分则是受体部分。这一技术的优势在于：受体为人体内蛋白，无免疫原性；该结构简单，仅需要表达两种组分，在细胞内一次组装成成品；受体可位于抗体的N端或C端，结合不同配体（抗原）时不相互影响；有的受体与配体（抗原）的亲和力比抗体还高；有的受体可以结合多个配体（抗原），具有多功能性等优势。目前，采用这一技术比较出名的项目是M7824项目（PD-L1/TGFβRII），该项目I期临床试验有效率达71.4%，非小细胞肺癌有效率达80%，为免疫治疗最高ORR，临床II期M7824将直接挑战Keytruda[10]。

本研究将抗PD-1抗体重链C端与VEGFR1的功能区Ⅱ（D2）VEGFR 2的功能区Ⅲ(D3)）通过柔性片段(GS4)3连接构建的Y-trap双功能抗体。该双功能抗体具有高亲和性结合PD-1和VEGF-A的功能。通过转基因小鼠研究结果表明， BY24.3免疫融合蛋白其抑瘤效果可能远远好于目前上市的两个产品Nivolumab和Aflibercept，具有超越PD-1抗体药物对肿瘤20-30%有效率的能力，因此具有很好的临床运用前景。