海沙瑞林对慢性心力衰竭大鼠心交感神经重构的影响*

王艺全 周春雪 李梅秀 田国忠

（佳木斯大学解剖学教研室，佳木斯 154007）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）死亡率高达50%，探索CHF发病机制及寻找有效的治疗药物备受国内外学者关注[1-3]。与自主神经失调有关，CHF早期即出现心交感神经的激活和交感神经重构[4-5]，即心脏神经纤维发生形态、分布及密度的改变[6]。而CHF后期，交感神经系统的激活和交感神经重构易致恶性心律失常乃至猝死的发生。因此，通过改善心交感神经重构已经成为治疗心衰的又一个重要靶点。海沙瑞林（hexarelin）是一种高度稳定的生长素释放肽（growth hormone releasing peptide，GHRP）的修饰物[7]。GHRP是一种人工合成的、能促使垂体生长素释放的促分泌肽类物质，对心肌而言，有与生长素类似的作用[8]。研究发现海沙瑞林对CHF心肌细胞具有保护作用[9-10]。本研究应用海沙瑞林干预CHF大鼠，探讨其对CHF心交感神经改变的影响。

1 材料和方法

1.1 动物分组及模型的建立

雄性健康SD 大鼠80 只（由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号211002300041251），体质量200 g±20 g，在佳木斯大学动物实验中心适应1 周，温度22 ℃±2 ℃，12 h 的光暗循环下自由进食水。将大鼠分为正常组（Control 组，n=8）、假手术组（Sham 组，n=8）、心力衰竭模型组（HF 组，n=22）和海沙瑞林干预组（HF+Hx组，n=22）。模型制备4 周后，各组大鼠经尾静脉注射给药，HF+Hx 组大鼠尾静脉注射hexralin 100 μg·kg-1·d-1（购自 Prospec 公司，美国），其他3 组大鼠均使用等量生理盐水进行处理，持续4 周。Sham 组与HF 组开胸及手术方法均相同，只穿线不结扎左前降支。

模型制作采用结扎左冠状动脉前降支的方法，大鼠于手术前12 h 禁食，6 h 禁水，每只大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛3.0 ml/kg 进行麻醉，麻醉后仰卧固定于自制手术台上，连心电监护电极。大鼠颈部备皮，沿气管纵向开口，逐层分离肌肉，暴露气管，用眼科剪将一节气管开一小口，连接小动物呼吸机，呼吸比为2∶1，呼吸频率75 次/分，潮气量4 mL/kg。大鼠左胸前区备皮消毒后铺无菌单，弧形切口切开皮肤，钝性分离浅筋膜，沿胸大、小肌分离肌腱膜，在心跳最明显处，也就是第3 肋间小心分离肋间内、外肌，轻轻扩开肋间隙后，将心表面被膜剥离，轻轻挤出心，用6-0 号无损伤线于左心耳与肺动脉圆锥之间从左向右进针，外科结结扎大鼠左前降支。结扎区域可见心肌颜色变浅，搏动减弱，心电图肢体导联、胸导 V1、V2、V3 导联可见ST 段改变，视为制造模型成功，否则弃之。快速还纳心，放置负压吸引管，负压吸引排空胸腔内残余的气体，肋间隙、肋间肌肉、皮肤逐层缝合，撤掉呼吸机后缝合气管，观察大鼠可缓慢自主呼吸后，快速缝合颈部皮肤，立即给予充分保温条件，观察实验大鼠，于手术后30～60 min 苏醒，给予食水，放回笼养，分笼饲养，并连续3 d 给每只手术大鼠肌肉注射20 000 IU 青霉素预防感染。

1.2 大鼠心超声心动图检测

于术后8周末测定各组大鼠心功能。使用Vevo 2100 Image System小动物超声机10 M 小动物探头进行测定，探头于其左胸取得满意的胸骨旁左心室短轴二维图像后，从乳头肌水平将M 型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得超声心动图，测定左心室的各项指标。测量指标为左室舒张末期直径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左室收缩末期直径（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左室舒张末期 容 积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左室收缩末期容积（left ventricular end-systolic volume，LVESV）、左室缩短分数（left ventricular fractional shorting，LVFS）及左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）值。

1.3 取材与染色

给药4 周末进行超声心动图检测后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘除心后置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，经乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，将包埋好的组织冷却2 h，片厚5 μm 连续切片，爬片后放置，分别进行H-E 染色和Masson 染色。

1.4 免疫组织化学显色

应用免疫组织化学（SABC）显色法检测心肌细胞内脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）表达水平，胞质中呈现棕黄色颗粒为阳性表达。兔抗BNP抗体（1∶500）购自美国Abcam公司；兔抗NGF抗体（1∶50）、兔抗TH抗体（1∶50）和兔抗GAP43抗体（1∶50）均购自美国Affinity公司。使用Leica DM4000B型生物显微镜、Leica DFC450数字照相机和Application Suite图像采集软件对免疫组织化学显色的组织切片进行各组抗体切片图像采集，然后使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对采集的图像相对积分光密度值进行计算分析。

1.5 心肌组织免疫印迹检测

取50 mg 左心室心肌组织，用裂解液提取组织总蛋白，BCA 法定量后行常规免疫印迹检测BNP、NGF、TH 和GAP43 表达。Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH（1∶1 000，购自中杉金桥公司）为内参，以目的条带与内参条带的灰度值比代表蛋白质相对表达量。其中一抗稀释倍数分别为BNP（1∶500），NGF（1∶500）、TH（1∶500）、GAP43（1∶1 000）。

1.6 统计学处理

使用SPSS24.0 软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠存活率

海沙瑞林干预4 周后仍存在大鼠死亡情况，死亡主要原因为重度心力衰竭。其中HF 组存活率为72.72%，而HF+Hx 组存活率为81.81%（表1），提示海沙瑞林的干预提升了大鼠的存活率。

表1 各组大鼠存活率Tab1 Results of rat survival rates in each group

2.2 大鼠心电图变化

大鼠术前心电图为正常窦性心律，律齐，各波形完整；结扎左冠状动脉前降支手术后5 min 心电图显示T 波振幅加大，ST 段弓背向上抬高明显，作为大鼠心肌梗死手术成功的标志。

2.3 各组大鼠左心室心功能实验

8 周末超声心动图可见HF 组大鼠左心室腔扩大明显，左心室运动减弱，左室运动波形几乎消失（图1）。与对照组和Sham 组比较，HF 组LVEDD、LVESD、LVEDV 和LVESV 均明显增加（P＜0.05），LVFS 和LVEF 明显降低（P＜0.05），差异均有统计学意义；与HF 组比较，HF+Hx 组LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV 均显著降低（P＜0.05），LVFS 和LVEF明显升高（P＜0.05），差异均有统计学意义（表2）。结果表明，通过结扎冠状动脉前降支的方法制备的心梗后心衰大鼠模型8 周末LVEF 降低，符合心力衰竭模型的要求；HF+Hx 组LVEF 较HF 组升高，表明Hexarelin 干预对防止心衰早期模型大鼠心功能恶化有积极的作用。

图1 对照组（A）与心力衰竭组（B）超声心电图Fig1 Echocardiogram in control（A）and HF（B）groups

表2 各组大鼠左心室心功能实验结果（n=6，±s）Tab2 Results of left ventricular cardiac function in rats of each group（n=6，±s）

表2 各组大鼠左心室心功能实验结果（n=6，±s）Tab2 Results of left ventricular cardiac function in rats of each group（n=6，±s）

#P＜0.05 vs control group ；*P＜0.05 vs HF group

Group LVEDV（mm³）LVESV（mm³）LVEF（%）LVEDD（mm）LVESD（mm）LVFS（%）Control 197.85±12.56 20.97±2.96 89.55±0.91 6.23±0.17 3.85±0.17 42.48±2.21 Sham 198.99±8.18 23.38±1.08 88.12±0.43 6.43±0.21 3.88±0.12 39.54±2.35 HF 460.94±22.20# 267.25±19.12# 42.85±3.03# 8.41±0.48# 6.73±0.48# 20.07±2.8#HF+Hx 327.99±18.66* 158.13±14.62* 53.47±4.27* 7.33±0.24* 5.58±0.28* 23.87±2.54*

2.4 各组大鼠心结构病理变化

2.4.1 H-E 染色 与对照组和Sham 组比较，HF 组心肌细胞排列紊乱，大小不一，纤维有断裂现象，部分细胞核溶解，细胞间隙大量纤维瘢痕和炎症细胞浸润。与HF 组比较，HF+Hx 组心肌细胞心肌纤维断裂情况少，细胞核较完整，病理结构明显改善（图2，见封二）。

2.4.2 Masson 染色 HF 组大片蓝染，胶原纤维沉积明显（红色为正常组织，蓝色表示胶原纤维）。与HF 组比较，HF+Hx 组蓝染面积下降，纤维化程度和胶原沉积明显降低（图3，见封二）。

2.5 BNP、NGF、TH 和GAP43 的蛋白表达

大鼠心肌细胞内BNP、NGF、TH 和GAP43 蛋白阳性染色呈棕黄色，表达定位于胞质内（图4，见封二）。HF 组BNP 阳性表达量较对照组和Sham组显著升高，HF+Hx 组BNP 蛋白阳性表达量较HF 组显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。HF 组NGF、TH 和GAP43 阳性表达量较对照组和Sham 组显著升高，HF+Hx 组NGF、TH 和GAP43蛋白阳性表达量较HF 组显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

与对照组和Sham 组相比，HF 组BNP蛋白水平显著升高（P＜0.05），NGF、TH 和GAP43的蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与HF 组相比，HF+Hx 组BNP 蛋白水平降低（P＜0.05），NGF、TH 和GAP43 蛋白水平升高（P＜0.05）（表4，图5）。

表3 各组大鼠心肌内BNP、NGF、TH 和GAP43 相对积分光密度值（n=6，±s，IOD/area）Tab3 Relative integrated optical density of BNP，TH，NGF and GAP43 in myocardium of each group（n=6，±s，IOD/area）

表3 各组大鼠心肌内BNP、NGF、TH 和GAP43 相对积分光密度值（n=6，±s，IOD/area）Tab3 Relative integrated optical density of BNP，TH，NGF and GAP43 in myocardium of each group（n=6，±s，IOD/area）

*P＜0.05 vs control and sham groups；#P＜0.05 vs HF group

Group BNP NGF TH GAP43 Control 0.025±0.005 0.103±0.005 0.090±0.010 0.107±0.0171 Sham 0.022±0.008 0.113±0.0143 0.079±0.007 0.104±0.0117 HF 0.130±0.007* 0.029±0.0029* 0.021±0.006* 0.037±0.0081*HF+Hx 0.062±0.009# 0.046±0.0104# 0.038±0.005# 0.055±0.0095#

表4 各组大鼠心肌内BNP、NGF、TH 和GAP43 蛋白表达（±s）Tab4 Expression of BNP，NGF，TH and GAP43 proteins in myocardium of each group（±s）

表4 各组大鼠心肌内BNP、NGF、TH 和GAP43 蛋白表达（±s）Tab4 Expression of BNP，NGF，TH and GAP43 proteins in myocardium of each group（±s）

*P＜0.05 vs control and sham groups；#P＜0.05 vs HF group

Group BNP NGF TH GAP43 Control 0.940±0.008 1.414±0.006 1.428±0.003 1.634±0.012 Sham 0.943±0.006 1.431±0.014 1.368±0.006 1.623±0.011 HF 1.554±0.033* 0.673±0.085* 0.728±0.078* 0.835±0.059*HF+Hx 1.352±0.035# 1.031±0.072# 1.079±0.059# 1.037±0.081#

图5 各组大鼠心肌内BNP、TH、NGF 和GAP43 蛋白表达，免疫印迹Fig5 Expression of BNP，TH，NGF and GAP43 in myocardium of each group Western Blotting

3 讨论

在临床方面，超声心动图是评估心功能的主要途径[11]。HF 组超声心电图结果显示左心室射血分数显著降低，代表了CHF 大鼠心收缩和舒张能力受损，心力衰竭大鼠模型制作成功。海沙瑞林干预30 d 后，射血分数有所升高，心收缩功能有明显改善，起到了心脏正性肌力作用。本研究通过免疫印迹和免疫组织化学法检测了实验大鼠左心室心肌组织，BNP蛋白表达水平的增加是病理性左心室肥大的特征，这与H-E染色和Masson染色的病理实验结果一致，证实了海沙瑞林干预后改善了心肌损伤，对心肌细胞起到了保护作用。心交感神经系统也在心衰时期起到了重要作用，心衰的发生发展离不开心交感神经系统的过度激活[12]。心衰时，神经递质去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）释放增多，血浆中NE浓度显著升高[13]。交感神经的持续活化和高浓度NE对心肌产生毒性，诱导心肌细胞凋亡以及心肌交感神经密度下降[14-15]。过量的NE还会导致NE 受体的反应性和蛋白表达下降[16]，心肌对NE 的敏感性随之下降，而心肌收缩力的增加有限，心舒张功能发生障碍，心肌进一步肥厚。因此，交感神经系统的激活与心功能不全等严重心脏疾病的进程和疾病的预后都有着重要联系。NGF是一种神经营养因子，有促进交感神经生长和延伸轴突的作用，对心衰后交感神经系统具有重要的调控作用[17-18]。Poole 等[19]证实了外源性补充NGF 可以成功诱导交感神经轴突的生长。Glebova 等[20]将NGF 和bax 基因缺失的实验鼠作为实验对象，证明了NGF 基因缺失的大鼠心交感神经分布明显减少，也同样体现了NGF 对交感神经的重要调控作用。本研究也同样证实了前人的实验结果。TH 是NE 合成代谢通路的关键酶，其在心肌组织中的表达量可表示心交感神经的活性，其表达下调可引起交感神经末梢功能异常。GAP43 是一种轴突膜神经特异性蛋白，参与心神经生长过程，与神经再生与突触发育有关[21]，与NGF 结果结合可更准确反映交感神经分布及密度。本研究检测到心衰大鼠心肌细胞BNP 蛋白表达上调，心肌细胞肥大，心肌细胞丢失严重，胶原蛋白沉积代替死亡的心肌细胞发挥作用，导致间质病理性纤维化，交感神经纤维断裂坏死，血浆内NE 浓度升高，加重对心肌的损伤，心肌细胞内NGF、TH 和GAP43 蛋白表达下调，对心交感神经的调节作用减弱，心交感神经支配失衡，心交感神经重构。

在海沙瑞林干预下，NGF、TH 和GAP43 蛋白表达明显升高，改变了交感神经重构，分析海沙瑞林可能是通过增加TH 蛋白表达来修复神经末梢对NE 的再摄取功能，NGF 和GAP43 蛋白表达的上调预示着交感神经的再生能力，可通过修复受损的神经纤维来延缓心衰进程。因此交感神经重构可能是治疗心力衰竭的潜在目标，而阻断交感神经重构是达到对心力衰竭有效预防和治疗的关键。海沙瑞林显著改善心衰大鼠左心功能，有效阻止心肌细胞内NGF、TH 和GAP43 蛋白表达的下降，通过改变心交感神经重构来改善CHF 的预后是其实现心保护的机制之一，以期能为开发海沙瑞林在心保护方面的研究提供一定的实验数据。

图2 各组大鼠心组织结构，H-E 染色，标尺=100 μm。A：对照组；B：Sham 组；C：HF 组；D：HF+Hx 组.Fig2 Cardiac histostructure in each group，HE staining，bar=100 μm.A：Control group；B：Sham group；C：HF group；D：HF+Hx group.

图3 各组大鼠心组织结构，Masson 染色，标尺=100 μm。A：对照组；B：Sham 组；C：HF 组；D：HF+Hx 组.Fig3 Cardiac histostructure in each group，Masson staining，bar=100 μm.A：Control group；B：Sham group；C：HF group；D：HF+Hx group.

图4 各组大鼠BNP（A1～D1）、NGF（A2～D2）、TH（A3～D3）和GAP43（A4～D4）蛋白表达，免疫组织化学显色，标尺=100 μm。A：对照组；B：Sham 组；C：HF 组；D：HF+Hx 组.Fig4 Protein expression of BNP（A1-D1），NGF（A2-D2），TH（A3-D3）and GAP43（A4-D4）in each group，bar=100 μm.A：Control group；B：Sham group；C：HF group；D：HF+Hx group.