胍丁胺对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤的治疗效果

孙惠萍 徐惠娟 戴加乐

（浙江省荣军医院药剂科，嘉兴 314000）

各种原因导致的肺部毛细血管通透性增加及肺泡上皮细胞受损可导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）发生，若不及时处理可导致死亡[1]。由于发生机制不明，急性肺损伤死亡率一直居高不下。在急性肺损伤的发生过程中，严重的氧化应激及炎症损伤是导致肺组织发生过度炎症重要因素之一[2]。因此，开发可控制肺组织氧化应激及炎症损伤的药物是治疗急性肺损伤的研发方向。胍丁胺是一种具有抗炎及抗氧化作用的内源性生物酶类物质，主要分布于脑、肺等器官中[3]。新近研究表明，胍丁胺可通过抑制大脑中胶质细胞的氧化应激反应而保护神经系统；同时，也可通过降低炎性细胞因子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等物质的表达，对酵母多糖诱导的大鼠全身炎症反应发挥治疗作用[4-5]。胍丁胺作为一种潜在的抗氧化应激及炎症反应的药物，尚不清楚其是否也可应用于急性肺损伤的治疗过程中。因此，本研究构建大鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤模型并予以不同剂量胍丁胺治疗，评估其治疗效果并初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

6 周龄雄性SD 大鼠，体质量（200±20）g，购自南京模式动物研究中心；LPS（L2800）、胍丁胺硫酸盐（A7127）购自美国Sigma；大鼠IL-6 试剂盒（PI328）、大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（PT516）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（S0101）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（S0131）购自碧云天上海有限公司。

1.2 急性肺损伤模型建立及实验动物分组

将60 只大鼠随机分为4 组，每组15 只：对照组（Control 组）、单纯模型组（LPS 组）、低剂量胍丁胺治疗组（低剂量胍丁胺组）和高剂量胍丁胺治疗组（高剂量胍丁胺组）。LPS 组、低剂量胍丁胺组和高剂量胍丁胺组大鼠采用腹腔注射 100 μL 的LPS（3 mg/kg），建立急性肺损伤模型，对照组注射等量PBS；低剂量胍丁胺组和高剂量胍丁胺组于LPS 注射前40 min，分别腹腔注射 6 mg/kg 胍丁胺和12 mg/kg 胍丁胺。

注射后每组随机抽取10 只大鼠饲养7 d，用于观察生存情况。在注射24 h 后，采集每组剩余5 只大鼠的肺组织标本进行相应的处理。

1.3 药物治疗大鼠生存率评估、肺部组织病理学观察及湿重、干重测定

1.3.1 湿重/干重比测定及肺部组织病理学观察 收集大鼠肺部右上叶组织用于湿重/干重比值：用PBS 冲洗肺组织2 次以去除表面残血，用滤纸吸干水分后称重，作为湿重（W）；随后，将其置于70 ℃烤箱中蒸发水分至恒定重量，记为干重（D），计算W/D 比值并记录。收集肺部右中叶于4 %多聚甲醛中进行固定，随后行H-E 染色，评估肺组织炎症情况。

1.3.2 肺组织中 SOD 活性和MDA 含量测定 称取100 mg 大鼠右下肺组织，使用PBS 冲洗后，加入预冷的1 mL RIPA 裂解液。使用Auto HG-24 plus 全自动匀浆机研磨成组织匀浆。4 ℃，10 000 r/min 离心收集上清液用于SOD、MDA 试剂盒检测，操作步骤依照说明书进行。

1.3.3 ELISA 法检测肺组织及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 水平 在大鼠左肺支气管插入灌洗针并结扎固定，分3 次将4.5 mL PBS 注入气管中，停留2 min 后，回抽3.5 mL 作为肺泡灌洗液。4 ℃，3 000 r/min 离心收集上清液，分装后用于检测细胞因子。称取100 mg 大鼠右下肺组织100 mg，研磨为组织匀浆，操作同1.3.2。匀浆后4 ℃，10 000 r/min 离心收集上清。使用商业试剂盒检测组织液及肺泡灌洗液中细胞因子IL-6、TNF-α 含量，依照说明书流程处理。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0 进行统计学分析。计量资料采用±s表示；绘制Kaplan-Meier 生存曲线，并采用Log Rank 分析各组生存率；组间比较采用oneway ANOVA 进行分析，组间两两比较采用LSD 法。

2 结果

2.1 大鼠生存率、肺部组织病理学观察及W/D

LPS组大鼠的生存率明显低于低剂量及高剂量胍丁胺组（P＜0.05），而低剂量和高剂量胍丁胺组之间的成活率差异无统计学意义（图1）。H-E染色显示，与对照组比较，LPS组有肺泡间隔增厚，并伴随大量炎症细胞浸润。经过低剂量及高剂量胍丁胺治疗后，炎症有所缓解（图2）。与对照组比较，LPS组肺组织W/D明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与LPS组比较，低剂量及高剂量胍丁胺组的W/D下降，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

2.2 肺组织中SOD 活性和MDA 含量

与对照组比较，LPS 组的肺组织存在MDA 含量上升、SOD 活性下降的现象，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。经不同剂量胍丁胺治疗后，可显著抑制MDA 含量上升、SOD 活性下降的现象，与LPS 组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 肺组织中SOD 活性和MDA 含量（±s）Tab1 The activities of SOD and the contents of MDA in lung tissue（±s）

表1 肺组织中SOD 活性和MDA 含量（±s）Tab1 The activities of SOD and the contents of MDA in lung tissue（±s）

*P＜0.05 vs control group ；△P＜0.05 vs LPS group

SOD（U/mgprot）Control group 9.53±0.79 429.78±40.24 LPS group 20.14±1.02* 300.23±43.08*Low-dose agmatine group 15.53±2.09*△ 389.46±51.92*△High-dose agmatine group 14.86±1.36*△ 396.36±35.21*△Group MDA（nmol/mgprot）

2.3 肺组织及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 水平测定

肺组织结果显示，与对照组比较，LPS 组TNF-α、IL-6 水平明显升高；而与LPS组比较，低、高剂量胍丁胺治疗组的TNF-α、IL-6 水平下降，且具有剂量依赖效应，以上差异均具有统计学意义（P＜0.01）（图4）。肺泡灌洗液结果显示，与对照组相比，LPS 组的TNF-α、IL-6 水平明显升高；而与LPS 组相比，低及高剂量胍丁胺治疗组的TNF-α、IL-6 水平下降，以上差异均具有统计学意义（P＜0.01）（图5）。

图1 各组生存率比较Fig1 Survival rate of each group

图2 各组肺组织H-E 染色，标尺=100 μmFig2 HE staining in lung tissues of each group，bar=100 μm

图3 各组肺组织湿干比Fig3 Wet-dry ratio of lung tissues in each group

图4 肺组织炎症因子表达水平Fig4 Expression level of inflammatory factor in lung tissues

图5 肺泡灌洗液中炎症因子表达水平Fig5 Expression levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid

3 讨论

过度的氧化应激与炎症反应可加重并导致急性肺损伤，故而采用相应治疗药物控制此类患者体内失衡的氧化应激和炎症反应是治疗的关键。常规的激素类药物虽可较好缓解患者病情，但存在较大的副作用，因此需开发其他潜在药物对其进行治疗。本研究探讨胍丁胺对LPS 诱导急性肺损伤的治疗效果，并评估肺组织中的反应氧化应激及炎症反应水平，旨在为胍丁胺的应用奠定前期研究基础。

生理条件下，左旋精氨酸在体内相关酶的催化下脱羧基形成胍丁胺，广泛分布于脑部及肺部等重要组织器官中[6]。胍丁胺不仅可通过与不同受体及离子通道结合来发挥抗焦虑作用，同时它也可通过抑制脑部的胶质细胞发生过度氧化应激反应发挥脑保护功能[7]。进一步研究表明，在酵母多糖建立的全身炎症模型中，胍丁胺可通过抑制小鼠体内NO水平的升高，来发挥治疗作用[5]。因此，胍丁胺是一种潜在的抗炎及抗氧化药物，有希望用于急性肺损伤的治疗过程中。本研究证实，在予以胍丁胺治疗后，LPS 诱导的大鼠肺损伤模型的死亡率明显降低，具有治疗效果。肺组织H-E 染色等结果也显示胍丁胺可抑制炎症细胞浸润来改善肺部炎症。急性肺损伤导致肺水肿也是加重病情的重要因素，本研究结果显示胍丁胺治疗后肺组织W/D 减少，这表明胍丁胺可降低肺部血管通透性，减轻病理损伤。考虑到常规急性肺损伤模型中的治疗药物以激素为主，过量使用时，具有较大副作用，而胍丁胺作为一种生理条件下的正常产物，其在安全性上具有更多优势，更具临床推广优势。

过度的氧化应激损伤会影响包括肺组织在内的多种器官的正常功能，并加重炎症反应[8-9]。存在于细胞内的SOD 酶是细胞内氧化剂清除剂，可反映体内清除氧自由基的能力；而MDA 是脂质氧化的产物，可反映患者体内氧自由基的产生水平，并间接反映细胞受到氧化损伤的程度[10-11]。结果显示急性肺损伤大鼠模型经过胍丁胺治疗后，会出现MDA 含量下调、SOD 酶活性上升的表现，提示其可通过促进抗氧化物（如SOD 酶等）的生成来减轻肺部氧化应激反应，进而导致MDA 生成减少，从而发挥治疗效果。同时，检测肺组织及肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6 水平显示，经过治疗后的肺组织中的细胞因子表达下调，同样表明胍丁胺具有抑制炎症作用，与既往研究相符。以上研究均表明，肺部局部给药后，会提高肺组织抗氧化水平，那么在临床应用中可通过药物雾化吸入方式来辅助急性肺损伤的治疗，来改善患者病情。

本研究同样存在不足，如未深入探究胍丁胺抑制肺部氧化应激反应的分子机制，同时，其对于肺部包括巨噬细胞等炎症细胞的影响也尚待评估。本研究设置的剂量梯度仅仅在肺组织的细胞因子中，而没有在W/D 及肺泡灌洗液细胞因子中产生差异，这有可能是检测对象存在差异而产生的结果。但是与LPS 组比较，低及高剂量胍丁胺组的肺损伤指标均有改善。尚需要后续进一步进行实验，扩大浓度梯度，来筛选最适合的用药剂量。

综上，胍丁胺可抑制肺部过度氧化应激及炎症反应，发挥对急性肺损伤的保护作用。