超高压和热处理对果蔬中四种香气合成酶活性与结构的影响

刘德讲,陈计峦,裴龙英

(1.信阳市质量技术监督检验测试中心,河南信阳 464000;2.石河子大学,新疆石河子 832003;3.新疆理工学院,新疆阿克苏 843000)

在近些年的食品加工中,传统的热处理方式对热敏性食品以及食品中的酶、营养物质影响较大,非热加工技术日渐应用到食品生产中。尤其是超高压技术,相比与其他的非热加工技术,其商业化程度更高且应用最广的一种技术。超高压加工的草莓酱可以保留95%的氨基酸,而热加工处理的草莓酱营养物质损失严重且有异味[1]。Liu等[2]研究了高压(300～600 MPa)和高温瞬时(110 ℃/8.6 s)对芒果中抗氧化能力、糖类、有机酸、颜色等的影响,发现高压处理的芒果中维生素C、抗氧化能力、颜色等均比高温瞬时处理的样品接近新鲜芒果。在过去十几年中,美国、日本、法国、德国和英国等国家系统地研究了超高压处理对食品材料的性质、酶、风味、颜色和微生物的影响。

超高压可使酶被激活或者钝化,从而影响酶在香气合成途径中的作用,进而影响前体物质在香气物质之间的转化,最后使得果蔬整体的香气物质含量种类发生改变,从而改善风味[3]。挥发性成分的代谢途径复杂,主要以氨基酸代谢和脂肪酸代谢为主,新鲜水果和蔬菜的主要代谢风味物质是酯类、醇类和醛类等。在氨基酸代谢和脂肪酸代谢过程中主要的酶有氢过氧化物裂解酶(HPL)、磷脂酶(PLA)、脂氧合酶(LOX)、乙醇脱氢酶(ADH)、酰基转移酶(AAT)等。LOX酶主要参与以脂肪酸为前体的直链酯的合成[4];ADH和AAT主要将醛转化为醇以及醇转化成酯,同时,这种反应是可逆的反应[5-7]。磷脂酶是一类将非水合磷脂水解成脂肪酸和水合磷脂的酶,也是脂肪酶的一种。在不同的条件加工过程中,酶活性、底物的结构和浓度、pH、温度均会发生改变,不同处理条件下香气成分和风味酶的变化有其本身的特点和规律。Lambadarios等[8]报道在超高压过程中或解压以后残存酶活对实际果实系统可能有一个促进影响。

本文分析350～500 MPa压力的超高压处理、热处理(微波处理MW、高温处理TP)、空白组(CK)对果蔬中四种香气合成相关酶(脂氧合酶(LOX)、乙醇脱氢酶(ADH)、磷脂酶A2(PLA2)、酰基转移酶(AAT))的活性、结构(一级、二级和三级)以及之间相关性的影响,以期为以后改善香气和加工方式提供理论依据,同时使加工过程中原有风味得到最大限度的保留,提高商品价值,对精深产品的开发提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

耐高压塑料包装袋、ELISA检测试剂盒、MES、Tris、NADH、磷酸钾、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、丙烯酰胺、β-巯基乙醇、溴酚蓝、甘氨酸等试剂 均为分析纯,购于沃德生物有限责任公司;脂肪氧合酶(LOX,5 kU)、酰基转移酶(AAT,15 kU)、乙醇脱氢酶(ADH,15 kU)、磷脂酶A2(PLA2,1.5 kU)和亚油酸(LA) 美国sigma公司。

CBM-20A紫外分光光度计 日本岛津公司;Bio-rad Powerpac Universal SDS-PAGE电泳仪 美国Bio-Rad公司;MOS-450圆二色谱仪 法国MOS公司;HITACHIF-3500荧光分光光度计 日本日立公司;M1-L213B微波炉 美的集团;HH-42恒温油浴锅 常州国华电器有限公司;HPP.L.2-600/0.6超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司;PHSJ-4F pH计 山东晨拓科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

1.2.1.1 酶液的制备 LOX用0.05 mol/L pH9.0硼酸缓冲液配成0.10 mg/mL的酶液;AAT用0.20 mol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液配成0.10 mg/mL的酶液;ADH用0.20 mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液配成0.10 mg/mL的酶液;PLA2用0.20 mol/L pH7.4的Tris-HCl缓冲液配成0.10 mg/mL的酶液。

1.2.1.2 样品的处理 微波处理(MW)[9]:将30 mL 1.2.1.1制备好的各酶液放入灭菌的锥形瓶中并密封,采用微波功率600 W加热45 s后取出,迅速用流动自来水冷却到室温。

高温处理(TP)[10]:将1.2.1.1中制备的30 mL酶液置于带塞试管中,在121 ℃恒温油浴锅中加热45 s,迅速用流动自来水冷却至室温。

超高压处理[11]:将30 mL 1.2.1.1酶液放入真空包装袋中,真空包装机真空密封。超高压处理设定4个压力梯度:350、400、450、500 MPa;温度:45 ℃;保压时间:15 min,水为传压介质。通过循环泵将压力釜和水的温度加热到45 ℃。将样品置于高压釜内,调整高压釜内水位,开始处理。所有处理好的样品均放入冰箱中冷藏备用,放置时间小于4 h。

1.2.2 酶活性的测定

1.2.2.1 LOX的测定 参照宋丽军[12]的方法有稍微的改动。制备LOX底物亚油酸溶液:60 μL亚油酸,120 μL吐温20,4 mL蒸馏水,混匀后再加入60 μL 5.00 mol/L氢氧化钠溶液,充分摇匀至溶液澄清,定容至25.00 mL,置于冰箱冷藏备用。

活性测定:2.88 mL 0.05 mol/L pH9.0硼酸缓冲液,0.10 mL亚油酸溶液,最后加入0.02 mL酶液并混合均匀后。以硼酸缓冲液作对照。室温下在234 nm的波长处测定吸光度的变化(每隔20秒记录一次,共记录3 min),重复实验3次。

1.2.2.2 ADH的测定 根据Ke等[13]描述的方法稍加改动。3.00 mL反应体系中包含2.40 mL 0.10 mol/L MES-Tris缓冲液(pH6.5),0.15 mL 1.60 mmol/L NADH,0.15 mL 80.00 mmol/L乙醛,0.30 mL酶液,MES-Tris缓冲液作为对照,室温下于340 nm波长处测定OD值变化,加酶液15 s后开始计时,记录1 min内数值的变化,重复3次。

1.2.2.3 AAT和PLA2的测定 AAT和PLA2使用ELISA检测试剂盒(Shangle,Shanghai,China)按照制造商的说明进行测定活性。

酶活性定义:单位时间内,1.00 mL酶液吸光度变化0.001定义为1个酶活性单位(U)。

1.2.3 一级结构的测定 采用SDS-PAGE检测酶的一级结构。

10%分离胶配制:5.90 mL去离子水;5.00 mL丙烯酰胺贮备液;3.80 mL分离胶缓冲液;0.15 mL 10% SDS;0.15 mL 10%过硫酸铵;0.006 mL TEMED;总体积15 mL。

5%浓缩胶配制:3.40 mL去离子水;0.83 mL丙烯酰胺贮备液;0.63 mL浓缩胶缓冲液;0.05 mL 10% SDS;0.05 mL 10%过硫酸铵;0.005 mL TEMED;总体积5 mL。

注入10%的分离胶,待分离胶聚合后,在其上方注入5%的浓缩胶。按预定顺序加样,每孔上样量20 μL,开始电泳。电泳时浓缩胶电压为60 V,分离胶电压为80 V。电泳结束后取出胶片,采用考马斯亮蓝染液进行染色,室温下染色时间1～1.5 h。染色后取出胶片置于甲醇-冰醋酸脱色液中脱色10～12 h至凝胶背景清楚,其间更换多次脱色液。

1.2.4 二级结构的测定 利用圆二色谱测定二级结构。四种酶液的光谱扫描波长范围全采用全波长扫描,在室温下进行四次重复扫描。图谱经过仪器本底消除和溶液空白差减。扫描速度为20 nm/min,时间常数为2.0 s,带宽为1.0 nm。每种酶液的缓冲液分别作为空白校正数据。圆二色性以平均摩尔椭圆率(θ,deg·cm2/mol)表示。CD光谱采用K2D软件来分析所有酶的二级结构组成。

1.2.5 三级结构的测定 采用荧光光谱法检测酶的三级结构。先用蒸馏水进行仪器校准,LOX酶的激发波长λex=285 nm,扫描范围200～400 nm,灵敏度为6,狭缝为10 nm。AAT酶的激发波长λex=412 nm,扫描范围300～600 nm,灵敏度为5,狭缝为10 nm。ADH酶的激发波长λex=295 nm,扫描范围300～500 nm,灵敏度为2,狭缝为10 nm。PLA2酶的激发波长λex=280 nm,扫描范围290～450 nm,灵敏度为4,狭缝为10 nm。四种酶均在室温下测定,重复扫描三次。

1.3 数据处理

使用SPASS 17.0进行数据分析,且所有实验均有三组平行试验。绘图采用Origin 8.5。热图和相关性分析采用R语言中Complex Heatmap包。

2 结果与分析

2.1 超高压和热处理对LOX的影响

2.1.1 超高压和热处理对LOX活性的影响 由图1可以看出,经过不同压力和热处理后LOX活性均显著降低(P<0.05),且在超高压组内随着压力的增加呈降低的趋势,450和500 MPa处理的样品间的酶活性差异不显著(P>0.05)。两种热处理的LOX活性均显著低于超高压处理,TP组比空白组下降了61%。

图1 不同处理方式下LOX活性的变化

Rodrigo等[14]通过对番茄汁中的LOX酶研究发现,除高温失活外,在较高压力下例如550 MPa/12 min或600 MPa/10 min,LOX会失去更多活性,这与本实验结果类似。Apichartsrangkoon等[15]发现LOX在300～500 MPa压力下活性会降低。在对超高压处理的哈密瓜汁研究中有类似结果,压力大于300 MPa时LOX酶活性被抑制[12]。

2.1.2 超高压和热处理对LOX一级结构的影响 LOX酶一级结构变化如图2所示,经过不同条件处理的LOX酶均只有一条条带,说明四种超高压处理和两种热处理均没有导致LOX分子肽链的断裂,也就是说LOX的一级结构没有发生变化。该结果与多种研究[12,16-17]相同,通过不同压力和温度对LOX进行研究发现,压力和温度都没有改变LOX酶的一级结构。

图2 不同处理后LOX的SDS-PAGE电泳图

2.1.3 超高压和热处理对LOX二级结构的影响 从表1可以看出,与空白组对比,经过不同处理后,α-螺旋的含量均减少,500 MPa样品下降最显著(P<0.05)。与空白组对比,随着压力的增加β-折叠含量呈显著增加的趋势,而微波处理的样品β-折叠含量显著下降(P<0.05)。除了400 MPa样品中无规则卷曲的含量有轻微的下降,经过不同处理后β-转角和无规则卷曲的含量均出现增加趋势,其中微波处理增加最显著(P<0.05)。

表1 不同处理后LOX二级结构含量的变化

王帮国[16]研究了超高压对LOX酶二级结构的影响,结果显示压力从150 MPa以50 MPa为梯度增加到400 MPa时,α-螺旋、β-折叠含量明显下降,并且随着压力增加,二级结构变化显著。与本实验结果有所差异的原因,可能是原材料和压力的取值不同。

2.1.4 超高压和热处理对LOX三级结构的影响 从图3中可以看出,空白组的荧光值最低,经过不同处理后荧光值均有所增加;超高压处理组随着压力的增加荧光强度呈增加的趋势,350与500 MPa相比峰向长波方向偏移,500 MPa样品在312 nm出现最高峰,峰值为496.64;TP处理在所有处理中荧光值最大,为569.09。以上可知,不同处理方式对LOX分子荧光强度的影响不同,造成这种现象的原因可能是压力和温度对一些芳香族残基例如色氨酸、酪氨酸有一定影响,使得这些氨基酸不断由分子内非极性环境中暴露在外部极性环境中,造成荧光强度明显增强。宋丽军[12]研究发现,不同压力和温度对LOX酶的荧光强度有影响,荧光强度随着压力的增加逐步增加,且温度对LOX酶的荧光强度也有显著影响，与本结论相似。

图3 不同处理后LOX的荧光光谱图

2.2 超高压和热处理对ADH酶的影响

2.2.1 超高压和热处理对ADH酶活性的影响 由图4可知,经过超高压和热处理后,ADH酶的活力有不同程度的增加(超高压500 MPa除外)。其中,TP样品增加最显著,达到了23.8 U/mL(P<0.05)。酶的活化原因可能是:第一,酶构象的可逆性或发生酶促反应的活性位点发生重排[18];第二,在增加压力后,距离基质近的酶的灵敏度可能增加;第三,在高压力条件下,溶剂被压缩使得反应速率增快,底物浓度可能会增大[19]。高压组内,随着压力的增大,400和500 MPa样品ADH的活力呈下降趋势,350和450 MPa样品间酶活力变化不显著(P>0.05),但500 MPa样品的活性急剧下降,值为12.7 U/mL,急剧下降的原因可能是压力达到了较高水平。

图4 不同处理方式下ADH活性的变化

酶活性的变化不仅与压力、温度、作用时间等外界环境密切相关,与其本身特性和内在原因也有较大关系,例如香蕉中乙烯含量与ADH活性成正相关[20],甜柿成熟前期可溶性单宁含量增加,ADH活性增加,果实脱涩后,ADH活性又出现降低现象[21]。

2.2.2 超高压和热处理对ADH一级结构的影响 从图5可以看,经过不同条件处理的ADH有且只有一条条带,说明4种超高压处理和2种热处理都没有导致ADH分子肽链的断裂,即超高压处理和热处理的ADH酶一级结构没有发生改变。

图5 不同处理后ADH的SDS-PAGE电泳图

2.2.3 超高压和热处理对ADH二级结构的影响 由表2可以看出不同处理条件下ADH的二级结构的变化。空白组中α-螺旋的含量为9.1%,400 MPa时,α-螺旋的含量急剧降到了0.2%。TP处理中α-螺旋的含量恰好相反,出现显著的增加,在所有处理中α-螺旋的含量最高,可能是较高温度所导致的。超高压组的β-折叠的变化与α-螺旋的变化趋势相似。超高压组β-转角的变化与空白相比,350和500 MPa样品的含量均有所增加,而450 MPa变化不显著(P>0.05)。随着压力增加,与空白组对比,β-转角有不同程度的增加(450 MPa除外)。在微波处理中β-转角的含量只有2%,是所有处理中最低。无规则卷曲的变化比较多样,微波加热中无规则卷曲的含量最高,达到了90%。推测可能是较高的温度导致维持ADH酶分子立体构象的部分次级键断裂或者不稳定,导致其构象进一步崩溃。

表2 不同处理后ADH的二级结构含量变化

2.2.4 超高压和热处理对ADH三级结构的影响 图6是ADH酶经过不同处理后的荧光光谱图，经过不同方式处理后ADH的荧光强度均有所降低。CK组的荧光峰值最大,为238.23,其次是微波处理;超高压处理组中,500 MPa荧光峰值最大,其次是350、450、400 MPa,且峰位有不同程度的偏移,其中350 MPa处理的样品与400和450 MPa样品比较,出现了341～351 nm处向右10 nm的最大偏移。出现偏移主要是因为压力和温度的存在,与蛋白质浓度无关[22]。超高压处理与热处理对比发现,两种加热处理的ADH酶荧光强度高于350～450 MPa的荧光强度。

图6 不同处理后ADH的荧光光谱图

2.3 不同超高压和热处理对AAT的影响

2.3.1 不同超高压和热处理对AAT活性的影响 由图7可以看出,空白组样品的AAT酶活力最高,为27.93 U/mL。经过不同压力和热处理后AAT酶活力均出现不同程度的降低。超高压组中,400 MPa样品的活力最大达到了25.5 U/mL,其后依次是350、500、450 MPa的酶活。热处理组中TP样品的AAT活性显著降低(P<0.05)。

图7 不同处理方式下AAT活性的变化

2.3.2 超高压和热处理对AAT一级结构的影响 从图8中可以看,经过不同条件处理的AAT酶有且只有一条条带,说明4种超高压处理和2种热处理均没有导致AAT分子肽链的断裂,也就是说不同压力的超高压处理和不同的热处理方式均没有改变AAT酶的一级结构。

图8 不同处理后AAT的SDS-PAGE电泳图

2.3.3 超高压和热处理对AAT二级结构的影响 由表3可知,与空白组相比,350、400、500 MPa和TP处理中α-螺旋含量有显著提高(P<0.05),450 MPa和MW处理中α-螺旋含量有显著减少(P<0.05),MW样品中α-螺旋含量最少仅有2.8%。β-折叠的变化与空白组相比,450 MPa和微波处理中β-折叠有显著增加,含量分别为45.9%和49.0%,而TP处理下降最明显,含量仅有0.3%。无规则卷曲经过不同处理后均有不同的降低。从整体来看,350、500 MPa以及TP处理的变化主要以α-螺旋为主,而450 MPa和MW处理主要以β-折叠的为主。

表3 不同处理后AAT的二级结构含量变化

2.3.4 超高压和热处理对AAT三级结构的影响 由图9可以看出,以空白组为分界线,超高压处理组的荧光光谱均在空白组之上,两种热处理均在空白组之下,即经过不同高压处理增强了AAT酶的荧光强度,且峰位均向左有不同程度的偏移,而经过热处理后减弱了AAT酶的荧光强度,但峰位没有发生偏移。原因可能是,超高压处理破坏了酶分子中键的连接模式,拉远了酶分子中的色氨酸残基和酪氨酸残基等氨基酸之间的距离,使酪氨酸无法再把其能量通过共振形式传递给色氨酸,从而使荧光强度改变[23]。

图9 不同处理后AAT的荧光光谱图

2.4 不同超高压和热处理对PLA2的影响

2.4.1 不同超高压和热处理对PLA2活性的影响 从图10可以看出,经过超高压和加热处理后,PLA2活力呈现逐渐降低的趋势(P<0.05)。在超高压组中,随着压力的增加整体也呈现降低的趋势,热处理组中TP样品在所有处理中酶活性最低(P<0.05)。Suladze等[24]使用傅里叶红外光谱分析了PLA2的活性,结果与本实验相似,均表明较大压力会降低PLA2酶的活性,其原因分析可能是较强的压力使酶与底物结合的状态受到破坏导致的。

图10 不同处理方式下PLA2活性的变化

2.4.2 超高压和热处理对PLA2一级结构的影响 如图11是PLA2在7种条件下的SDS-PAGE电泳图,经过不同条件处理的PLA2酶液有且只有一条条带,说明无论是超高压处理还是热处理均没有使PLA2分子肽链断裂,也就说明超高压处理和热处理均没有改变PLA2酶的一级结构。通常,通过几次共价相互作用构建的酶的一级结构在加压时不受影响。高压通过改变静电和疏水相互作用以及氢键影响酶的三级和四级结构[25]。Hayakawa等[26]通过其β-螺旋含量和示差扫描量热法(DSC)吸热焓的降低来证实,压力处理只有构象变化,因为没有观察到PAGE图谱的变化。

图11 超高压和热处理处理后PLA2的SDS-PAGE电泳图

2.4.3 超高压和热处理对PLA2二级结构的影响 由表4可知,空白组中80%都是α-螺旋和β-折叠这两种结构。经过不同压力和热处理处理后,α-螺旋和β-折叠含量均显著降低(P<0.05)。β-转角的变化与α-螺旋和β-折叠的变化相反,经过高压和热处理后β-转角的含量都有不同程度的升高,其中MW处理后β-转角的含量在所有处理中最高,达到了30.7%。无规则卷曲的变化与β-转角变化相似,经过高压和热处理后β-转角的含量都有不同程度的升高。Suladze等[24]使用高压停流荧光光谱研究高压对PLA2的结构进行研究,结果显示PLA2与生物膜的结合不受压力的显著影响,但可以钝化酶的活性,α-螺旋结构随着压力增加而减少。

表4 不同处理后PLA2的二级结构的变化

2.4.4 超高压和热处理对PLA2三级结构的影响 图12是PLA2酶经过不同的方式处理后的荧光光谱图,不同的处理方式PLA2酶的荧光强度和峰位都发生了不同程度的改变,但是峰型没有变化。空白组在336 nm处有荧光最大值为830.93,经过不同高压处理和热处理后荧光强度都有所降低,且热处理组均低于超高压处理组。在超高压处理组中,压力350～450 MPa荧光强度呈现降低的趋势,且随着压力升高，出现了向短波方向偏移的现象。推测其原因可能是超高压增强了色氨酸残基和酪氨酸残基的疏水特性,出现向短波方向偏移现象[27]。

图12 不同处理后PLA2的荧光光谱图

2.5 超高压和热处理条件下四种酶活性与结构的相关性分析

由表5可以看出,经过超高压和热处理后,LOX和PLA2活性均与α-螺旋呈显著正相关;超高压组的LOX与热处理组的ADH均与β-折叠呈显著负相关,相关系数分别是0.935(P<0.01)、0.851(P<0.05);热处理组的LOX和超高压处理组的AAT与β-转角相关较强(P<0.01),相关系数分别是-0.960、0.776;超高压组的LOX与热处理组的PLA2均与无规则卷曲有显著负相关(P<0.05);不同处理的LOX、PLA2以及超高压处理的ADH均与荧光强度有显著相关。

表5 不同处理中四种酶活性与结构的相关性分析

酶是大分子，通常具有多级结构,分子结构的变化与活性的关系密切相关[28]。超高压处理是一种高强度动力作用,可能会破坏酶分子的高级结构并影响到活性。在对草莓汁的研究中也得出类似结论,酶空间结构的改变对酶活性有较大影响[29]。钟葵等[30]采用高压脉冲电场对LOX酶构象的研究发现,随着电场强度的增强,LOX酶分子中α-螺旋含量及酶活性降低,β-折叠含量增加,且与α-螺旋及β-折叠的含量呈良好的线性关系(R2>0.900)。Dallet等[31]发现酵母醇脱氢酶(YADH)的活性通过压力的增加而持续被抑制,同时不同压力对酶荧光强度有一定影响,进而对活性产生正面或负面影响。邱春江[17]发现温度大于70 ℃,LOX的α-螺旋、β-折叠含量降低,逐渐变成松散状态,进一步导致LOX变性,酶活降低,这与本实验结论类似。胡国洲[32]研究微波处理后活性与β-折叠含量又较强相关性。涂宗财等[33]研究得出蛋白质的微观结构与加工压力有关,圆二色谱显示了卵清蛋白在经过不同压力加工后α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲之间发生相互转化,且与活性有较大的相关性。

3 结论

超高压处理和热处理对LOX、ADH、AAT、PLA2酶的活性与二、三级结构有较大影响。其中随着压力的增加和不同的热处理LOX、AAT、PLA2酶活性降低,ADH活性升高;LOX经过超高压处理后α-螺旋含量明显降低,但荧光强度均高于对照组,活性与结构相关性分析中也显示α-螺旋、荧光强度均与LOX活性有强相关;ADH酶的荧光强度均低于对照组,活性与荧光强度有较大负相关;超高压处理后AAT的荧光强度均高于对照组,热处理组中AAT的荧光强度均低于对照组;经过超高压和热处理后PLA2酶α-螺旋含量有不同程度的降低,活性主要与α-螺旋、荧光强度有强烈相关性。