响应面法优化苹果醋醋酸发酵工艺

刘光鹏，初乐，朱风涛，张鑫，孙苗苗，高玲，赵岩*

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南 250014；2.绿杰股份有限公司，山东龙口 265718）

我国的苹果种植面积和产量均高居世界首位，但苹果的加工总量不足产量的20%，且加工形式以果汁加工为主[1]。苹果醋是以苹果汁为原料经微生物发酵而成的一种健康饮品，含有多种对人体有益的营养和功能成分，具备水果和食醋的双重保健功效[2-4]，而且苹果醋还可以作为调味品使用。我国目前市场上苹果醋产品大多以苹果浓缩汁为原料，更有甚者采用食醋、醋精、甜味剂和食用香料调配而成，而采用苹果鲜汁发酵的较少。随着人们对苹果醋产品保健效果的认知，以苹果鲜汁为原料酿造的苹果醋市场前景广阔[5-6]，苹果醋发酵技术也已成为苹果精深加工重点开展的研究方向之一。近年来对苹果醋发酵工艺和技术的研究较多，但大多集中在菌种选育、实验室摇床工艺优化及分析上[7-12]，只有少量利用醋酸专用发酵罐（自吸式发酵罐）进行食醋发酵的研究报道[13]，而苹果醋发酵工艺优化研究则鲜见报道。鉴于此，本试验对苹果醋发酵工艺进行了分析，并采用响应面法对苹果醋发酵过程的发酵温度、发酵时间、搅拌转速和接种量4 个因素的最佳工艺参数进行了探讨，旨在为苹果醋的工业生产提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

（1）菌种：酿酒酵母CTCF0001（Saccharomyces cerevisiae CTCF0001），醋酸菌 CTCF0001（Acetobacter aceti CTCF0001），以上两株菌均来自中华全国供销合作总社济南果品研究院发酵技术研究室。

（2）原料：烟台红富士苹果，绿杰股份有限公司；果胶酶，NOVOZYMES 公司。

（3）试剂：磷酸二氢钾、硫酸镁、盐酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、五水合硫酸铜、碳酸钙、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫酸镁等，均为分析纯；酵母膏、琼脂粉、食用酒精。

（4）培养基：液体种子培养基（葡萄糖1%、酵母膏1.5%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%，于121 ℃灭菌20 min，冷却后添加3%的酒精）；二级种子培养基：将经酵母发酵的苹果酒稀释至酒精度为3%～4%作为二级种子培养基。

1.1.2 仪器与设备

数显式电热恒温水浴锅，HH-4 型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；全自动立式压力蒸汽灭菌器，YXQ-LS-100A 型，上海博迅实业有限公司；智能型垂直流超净工作台，SW-CJ-2FD 型，苏州安泰空气技术有限公司；全温度恒温调速摇床柜，ZWYR-2112B 型，上海智诚分析仪器制造有限公司；数码生物显微镜，BA310C，Motic 麦克迪奥实业集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果醋发酵工艺流程

苹果→破碎→榨汁→一次杀菌→接种酵母菌（添加酶制剂）→酒精发酵→二次杀菌→接种醋酸菌→醋酸发酵→除渣→陈酿→过滤→三次杀菌→成品

1.2.2 操作要点

（1）酒精发酵

无菌条件下在发酵料液中接入适量的酵母菌，发酵初期可通入适量的空气，以利于酵母菌的迅速繁殖和酒精发酵，控制合适的发酵温度。当发酵液中酒精度在6.5%（v/v）以上、残还原糖含量在0.5%～0.6%时，即可认为酒精发酵结束，测定并记录发酵液的酒精度。

（2）醋酸菌的培养

一级种子培养：取一环活化后的醋酸菌种接入装有10 mL 液体种子培养基的试管中，在旋转式恒温摇床上于33 ℃、200 r/min 培养24 h。

二级种子培养：以1%（v/v）的接种量将培养24 h 后的一级种子转接至装有300 mL 二级种子培养液的两个1 000 mL 摇瓶中，在旋转式恒温摇床上于33 ℃、200 r/min条件下培养24 h。

（3）醋酸发酵

在酒精发酵醪液中接入醋酸菌二级种子液，控制合适的温度、转速、发酵时间等工艺参数，同时定时取样测定发酵液中的总酸，当总酸不再增加时，醋酸发酵结束。

1.2.3 醋酸发酵优化试验设计

（1）单因素试验

选择发酵温度33 ℃、发酵时间36 h、醋酸菌接种量8%、搅拌速率1 400 r/min 为因素，以发酵醪液中的总酸含量（即酒精的转化率）为考察指标，每次变化一个因素水平进行不同发酵温度、发酵时间、醋酸菌接种量和搅拌速率四项单因素试验。

（2）响应面优化试验

在单因素的基础上，以醪液中总酸含量为考察指标，以发酵温度、发酵时间、醋酸菌接种量和搅拌速率4 个因素为自变量，再用Design Expert 8.0 软件进行响应面优化，分析苹果醋发酵的最佳条件。

1.3 测定指标与方法

总酸：酸碱滴定法测定，参照GB/T12456-2008。

1.4 数据处理

通过Microsoft Excel 和Design Expert 8.0 软件统计分析试验数据，并对实验数据所得响应面模型进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苹果醋发酵的单因素试验

2.1.1 发酵温度对苹果醋总酸含量的影响

在苹果醋发酵时间48 h、醋酸菌接种量8%、搅拌转速1 400 r/min 的条件下，设定醋酸菌的发酵温度分别为27、30、33、36、39 ℃时，考察苹果醋发酵温度对总酸生成量的影响，试验结果见图1。

数据挖掘系统结构包括将数据挖掘系统与数据库/数据仓库系统耦合的各种考虑。有多重可能的设计:不耦合、松散耦合、半紧密耦合和紧密耦合。一个良好的设计的数据挖掘系统应当与数据库和/或数据仓库的紧密或半紧密耦合。这里所谓的“耦合(Coupling，结合，连结)”实际上就是要求多边矩阵剖面广义交叉乘积的运算方法应保证运算结果矩阵的阶数不高，数据信息比较集中。

图1 显示了发酵温度对醋酸菌的产酸速率具有显著影响。发酵温度过低，发酵缓慢、产酸速率低；发酵温度过高则导致酒精和醋酸菌的挥发加快，醋酸会氧化为二氧化碳和水，醋酸菌老化提前，使醋酸发酵效率变低。由图1 可知，在发酵温度为27 ℃和30 ℃时，醋酸菌产酸速度慢、时间长，最终发酵醪液中的总酸含量低。在发酵温度为33 ℃和36 ℃时，产酸量高，其中33 ℃终发酵醪液的总酸含量最高，发酵时间只需36 h。当发酵温度为39 ℃时，过高的发酵温度导致菌种提前老化，即使有较短的发酵周期，但是产酸量低。由试验结果得知，醋酸发酵的最佳温度为33 ℃。

2.1.2 发酵时间对苹果醋总酸含量的影响

在苹果醋发酵温度33 ℃、醋酸菌接种量8%、搅拌转速1 400 r/min 的条件下，设定醋酸菌的发酵时间分别为24、30、36、42、48 h 时，考察苹果醋发酵时间对总酸含量的影响，试验结果见图2。

醋酸菌发酵分为三个阶段。发酵前期是醋酸菌种适应期，菌种生长缓慢、产酸量少，发酵醪液酸度低；中期为醋酸菌的对数生长期，产酸速率加快，总酸快速增长；后期开始为醋酸菌氧化酶大量分泌，催化乙醇与空气中的氧结合形成乙酸，但氧化反应逐渐变缓，酸度趋于稳定，发酵时间继续延长，醪液中的醋酸含量反而缓慢下降。由图2 可知，发酵时间24～30 h 是苹果醋的总酸快速增加期，发酵时间在30～36 h 时，发酵液中的总酸继续增加，但总酸增加速率放缓，发酵36 h 时，苹果醋中的总酸达到最大值；发酵后期，醋酸菌活力减弱，酸度趋于稳定。若继续延长发酵时间，醋酸含量反而会下降，分析其原因，可能是因为耗氧发酵带走的醋酸产生量小于少量残余酒精转化成醋酸的量以及醋酸被转化为二氧化碳和水的量。根据试验结果，选择醋酸发酵的最佳时间是36 h。

2.1.3 醋酸菌接种量对苹果醋总酸含量的影响

在苹果醋发酵温度33 ℃、发酵时间48 h、搅拌转速1 400 r/min 的条件下，设定醋酸菌的接种量分别为4%、6%、8%、10%、12%时，考察醋酸菌的接种量对苹果醋总酸含量的影响，试验结果见图3。

由图3 可得，在其它条件一定的情况下，醋酸菌接种量为4%和6%时，发酵速率较为缓慢，产酸量相对较低；在醋酸菌接种量为8%和10%时，发酵醪液中的总酸变化趋势基本一致，12～30 h 产酸速率较快，发酵36 h 时，以8%接种量的发酵醪液中总酸浓度最高，36 h 后发酵醪液中的总酸含量有下降的趋势。当接种量为12%时，短时间内产酸速率最快，但最终发酵醪液中的总酸含量低于8%和10%接种量的总酸含量，分析其原因可能是因为接种量过多，发酵液中的营养物质并没有相应的增加，但是醋酸菌在生长繁殖时需要消耗较多的营养物质，造成醋酸生成量的减少，而且较大的接种量对发酵产品的风味会有不良影响[14]。结合试验数据分析，选择醋酸发酵的最佳接种量为8%。

2.1.4 搅拌转速对苹果醋发酵总酸含量的影响

在苹果醋发酵温度33 ℃、发酵时间48 h、醋酸菌接种量8%的条件下，设定搅拌转速分别为800、1 100、1 400、1 700、2 000 r/min 时，考察搅拌转速对总酸生成量的影响，试验结果见图4。

由图4 可知，搅拌转速对苹果醋发酵具有较大的影响。搅拌转速和发酵液中的溶氧存在较大的相关性。在发酵前12 h，由于醋酸菌对氧的需求较少，搅拌速率对醋酸的生成影响较小；发酵12 h 后，搅拌转速为800 r/min和1 100 r/min 时，由于发酵液中溶解氧的不足使得醋酸的生成较为缓慢，但搅拌转速1 100 r/min 的醋酸生成速率明显快于搅拌转速800 r/min 的醋酸生成速率；发酵速率高于1 400 r/min 时，发酵时间在0～36 h 的总酸增长曲线基本一致，但在30 h 后，以1 400 r/min 搅拌转速醪液中的总酸含量最高。分析其原因可能因为一方面过多的溶解氧使得醋酸菌生长旺盛，耗去发酵液中大量养分，另一方面转速过高使发酵液中酒精和醋酸挥发，发酵到后期转化率不断下降。因此，搅拌转速选择1 400 r/min。

2.2 苹果醋发酵的响应面试验

2.2.1 响应面分析方案及结果

在单因素试验的基础上，为了研究不同因素对总酸（醋酸）生成的影响，确定最优的苹果醋发酵工艺参数，选择发酵温度、发酵时间、搅拌转速、接种量作为响应面优化的考察因素。根据Design Expert 8.0 软件中的Box-Behnken 设计原理，设计四因素三水平响应面优化分析试验，以发酵醪液中的总酸生成量为响应值（Y），用-1、0、1来表示因素低、中、高三水平，试验设计见表1，结果见表2。

表2 的试验结果包括24 个取值在A、B、C、D 所构成的三维顶点，5 个区域零点重复试验点。对表中的试验结果进行回归分析，得到苹果醋发酵过程中总酸含量对发酵温度、发酵时间、搅拌转速、接种量的四元二次回归方程：Y=60.42+1.31A+3.05B+1.84C+1.92D+0.20AB-1.92AC-1.90AD-0.025BC-0.68BD-0.48CD-2.35A2-2.83B2-1.95C2-2.46D2。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 响应面试验设计及响应值Table 2 Response surface experimental design and results

对所得回归方程进行变异分析和显著性检验结果如表3 所示。由表3 可以看出，模型的回归项P＜0.013 9，表明所选择的响应面回归模型显著。失拟项P=0.997 1＞0.05，即失拟项差异不显著，表明该二次回归模型能够显著拟合发酵温度、发酵时间、搅拌转速、接种量对苹果醋中总酸生成量的影响，该模型能够替代试验真实点对试验数据进行分析。从表3 可得出四元二次回归方程系数的显著性，搅拌转速（C）、接种量（D）、发酵温度二次项（A2）、发酵时间二次项（B2）对苹果醋发酵的总酸含量具有显著影响；发酵时间（B）对苹果醋发酵的总酸含量具有高度显著影响；发酵温度（A）、发酵温度（A）和发酵时间（B）的交互项、发酵温度（A）和搅拌转速（C）的交互项、发酵温度（A）和接种量（D）的交互项、发酵时间（B）和搅拌转速（C）的交互项、发酵时间（B）和接种量（D）的交互项、搅拌转速（C）和接种量（D）的交互项对苹果醋发酵的总酸含量影响不显著。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 响应面模型分析讨论

利用Design Expert 8.0.5b 软件对表2 的试验数据进行四元二次回归拟合分析，所得响应面图见图5～10。各因素及其交互作用对苹果醋总酸生成量的影响结果可通过响应面图直观地反映出来。其中响应面图底部的等高线可以反映两因素相互作用的强弱，椭圆形表示两因素相互作用较强，圆形表示较弱[15-16]。图5 为发酵温度和发酵时间对醋酸生成量的影响，由图可知，发酵温度和发酵时间对醋酸生成量的交互作用较强，发酵时间较发酵温度对醋酸生成量的影响大，表现为等高线较陡和密集。图6 为发酵温度和搅拌速率对醋酸生成量的影响，由图可知，发酵温度和搅拌速率对醋酸生成量的交互作用较强，发酵时间和搅拌速率对苹果醋总酸的生成量均有显著影响。

图7 为发酵温度和接种量对苹果醋总酸生成量的影响，由图可知，发酵温度和接种量对总酸生成量的交互作用较强，苹果醋发酵接种量大于发酵温度对总酸生成量的影响。图8 为发酵时间和搅拌速率对总酸生成量的影响，由图可知，发酵时间和搅拌速率对总酸生成量的交互作用较强，发酵时间和搅拌速率对苹果醋总酸生成量均有较大影响。图9 为发酵时间和接种量对总酸生成量的影响，由图可知，发酵时间和接种量对总酸生成量的交互作用较强，发酵时间对苹果醋总酸生成量的影响稍微强于接种量。图10 为搅拌速率和接种量对总酸生成量的影响，由图可得，搅拌速率和接种量对总酸生成量的交互作用较强，接种高于搅拌速率对总酸生成量的影响。

2.2.3 最佳工艺参数的预测和验证

运用响应面软件对试验数据进行优化和预测，得到苹果醋发酵总酸生成量的最佳工艺参数为发酵温度33℃、发酵时间39 h、搅拌速率1 529.1 r/min、接种量7.3%，在此工艺参数下预测发酵醪液中醋酸生成量为61.9 g/L。结合实际生产的可操作性，将醋酸发酵的工艺参数改为发酵温度33 ℃、发酵时间39 h、搅拌速率1 500 r/min、醋酸菌接种量7%。在此工艺参数下对模型的预测参数进行验证，得到发酵苹果醋的总酸含量为62.22 g/L，与模型预测值很接近，说明采用响应面法优化得到的醋酸发酵的工艺参数可靠。

3 结论

以烟台富士苹果为原料，通过单因素试验初步研究了发酵温度、发酵时间、搅拌转速和接种量对苹果醋总酸生成量的影响。通过响应面分析方法建立了苹果醋总酸发酵工艺参数，即发酵温度、发酵时间、搅拌转速、接种量对苹果醋发酵总酸含量之间的响应面模型，可用于苹果醋发酵总酸含量的预测。在响应面试验所取发酵温度、发酵时间、搅拌转速、接种量参数的优化区间内，发酵温度对苹果醋发酵总酸含量影响不显著，发酵时间对苹果醋发酵总酸含量影响极显著，搅拌转速和接种量对苹果醋发酵总酸含量具有显著影响，发酵温度、发酵时间、搅拌转速和接种量各因素交互作用对总酸含量的影响不显著。试验得出，苹果醋发酵的最佳工艺参数为发酵温度33 ℃、发酵时间39 h、搅拌速率1 500 r/min、醋酸菌接种量7%。