槐花散对试验性结肠炎大鼠的保护作用

刘 萍 ， 钟 佳 ， 卞艺斐 ， 钟 沅 ， 刘钟杰

(1. 浙江农林大学动物科技学院·动物医学院 ， 浙江 杭州 311304 ； 2. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 3. 中国农业大学动物科技学院 ， 北京 海淀 100193)

槐花散是中兽医传统方剂，最早见于《普济本事方》。槐花散由槐花(SophorajaponicaL.)、侧柏叶[Platycladusorientalis(L.)Franco]、荆芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)和枳壳(CitrusaurantiumL.)成方。全方清肠止血，疏风行气，是治疗肠风、脏毒的常用方。本研究应用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium, DSS)诱导大鼠试验性结肠炎模型，探究槐花散对结肠炎大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 槐花(炒)、侧柏(炒炭)、荆芥(炒炭)和枳壳(炒)，均购自北京同仁堂马连洼分店。葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量36 000～50 000)，购自北京酷来搏科技有限公司；便隐血试剂盒，购自珠海贝索生物科技有限公司；大鼠C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)和大鼠单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) ELISA试剂盒，均购自武汉默沙克生物科技有限公司；大鼠白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)和大鼠肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA试剂盒，均购自美国R&D公司。

1.2 实验动物 SPF级SD大鼠，7周龄，体重(260±20)g， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。试验前饲养于通风独立笼具系统3 d，以消除应激。

1.3 方法

1.3.1 槐花散药液的制备 准确称量槐花100 g，侧柏100 g，荆芥100 g，枳壳100 g，与3.2 L的蒸馏水混合，浸泡30 min后，加热至沸腾。沸腾15 min后，倒出一半药液，再小火煮沸30 min，滤出剩余药液[1]。合并2次滤液后，经3层滤纸过滤去除多余滤渣。过滤后的槐花散药液使用旋转蒸发仪(45～50 ℃) 浓缩成浓度为1 g/mL的生药液，分装密封于-20 ℃ 保存。临用前用蒸馏水配成工作药液，使用蒸馏水作为空白对照。

1.3.2 实验动物分组和处理 大鼠随机分为5组，每组6只。分别为空白对照组(CON)、模型对照组(DSS)、高浓度槐花散组(DSS/HA)、低浓度槐花散组(DSS/HB)和槐花散对照组(HHS)。灌胃1次/d(10:00)，每次2 mL，持续8 d。从灌胃第2天开始，给予5% DSS饮水，持续7 d。空白对照组大鼠自由饮蒸馏水，每日2 mL蒸馏水灌胃；模型对照组大鼠自由饮5% DSS溶液，每日2 mL蒸馏水灌胃；高浓度槐花散组大鼠自由饮5% DSS溶液，每日2 mL 5.76 g/(kg·bw)槐花散溶液灌胃给药；低浓度药物组大鼠自由饮5% DSS溶液，每日2 mL 2.88 g/(kg·bw)槐花散溶液灌胃给药；槐花散对照组大鼠自由饮蒸馏水，每日2 mL，5.76 g/(kg·bw)槐花散溶液灌胃给药。

1.3.3 检测指标与方法

1.3.3.1 肠炎疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分 参照文献[2]进行大鼠DAI判定。评分标准见表1。其中，通过眼观粪便颜色，同时按照潜血试剂盒说明书进行粪便隐血检测。DAI由体重降低率评分、粪便性状评分和隐血评分相加而得。

表1 大鼠肠炎活动指数评分标准

1.3.3.2 结肠组织病理学观察 取结肠段固定于中性甲醛24 h后，石蜡包埋、切片、H.E.染色，进行组织病理学观察。

1.3.3.3 细胞因子水平测定 心脏采血4 ℃静置过夜，3 000 r/min离心10 min取上清后，按照试剂盒说明书进行血清TNF-α和IL-1β水平检测；取1 g结肠组织，制成10%匀浆取上清后，按照试剂盒说明书进行组织MCP-1和CRP水平检测。

1.4 数据处理 使用SPSS 17.0软件对试验结果进行分析处理。试验数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，单因素方差分析(One-way ANOVA)检验试验组间差异性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐花散对大鼠肠炎症状的影响 造模第2天起，除空白对照组和槐花散对照组，给予DSS饮水的各组大鼠均出现不同程度腹泻，精神沉郁和弓背表现。造模第4天，模型对照组出现粪便隐血强阳性甚至明显血便，而各药物治疗组大鼠腹泻、弓背症状相对改善。造模第7天，模型对照组大鼠腹泻严重，弓背明显，蜷缩扎堆，被毛逆立，精神萎靡。高浓度槐花散组和低浓度槐花散组大鼠症状有不同程度的减轻。

2.2 槐花散对肠炎DAI评分的影响 如图1所示，与空白对照组大鼠相比，模型对照组大鼠DAI评分显著升高(P<0.05)；与模型对照组大鼠相比，高浓度槐花散组大鼠肠炎DAI显著降低(P<0.05)，而低浓度槐花散组虽然有降低趋势，但无显著性差异(P>0.05)。

图1 大鼠肠炎DAI评分情况

2.3 结肠组织病理学观察 如中插彩版图2所示，空白对照组大鼠结肠黏膜结构完整，上皮细胞排列整齐，微绒毛清晰可见，腺体结构完整，隐窝结构完整；模型对照组大鼠结肠黏膜上皮细胞严重脱落，微绒毛完全消失，隐窝结构模糊不清，炎性细胞广泛浸润；高浓度槐花散组大鼠结肠黏膜完整，上皮细胞排列较整齐，微绒毛可见，隐窝结构完整，伴有轻微炎性细胞浸润；低浓度槐花散组大鼠结肠黏膜较完整，无明显上皮细胞脱落，微绒毛不明显，隐窝结构较完整。

2.4 槐花散对结肠炎大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影响 如图3所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠的血清TNF-α水平显著性升高(P<0.05)。与模型对照组相比，高浓度槐花散组和低浓度槐花散组的血清TNF-α水平显著性降低(P<0.05)；与空白对照组相比，模型对照组大鼠的IL-1β水平显著性升高(P<0.05)。与模型对照组相比，高浓度槐花散组和低浓度槐花散组大鼠血清IL-1β水平显著性降低(P<0.05)。

图3 槐花散对大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影响

2.5 槐花散对结肠炎大鼠结肠MCP-1和CRP水平的影响 如图4所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠的结肠CRP水平显著性升高(P<0.05)。与模型对照组相比，高浓度槐花散组和低浓度槐花散组的结肠CRP水平显著性降低(P<0.05)；与空白对照组相比，模型对照组大鼠结肠MCP-1水平显著性升高(P<0.05)。与模型对照组相比，高浓度槐花散组和低浓度槐花散组大鼠结肠MCP-1水平显著性降低(P<0.05)。

图4 槐花散对大鼠结肠CRP和MCP-1水平的影响

3 讨论

槐花散是中药传统方剂，最早见于南宋《普济本事方》。槐花散由槐花、侧柏叶、荆芥、枳壳构成，方中槐花为君药，清大肠湿热、凉血止血；侧柏叶、荆芥为臣药，侧柏助槐花凉血止血，荆芥祛风理血；枳壳为佐、使药，宽肠利气[3]。全方清肠止血，疏风行气，治肠风，脏毒，证属湿热内蕴者。近年来，槐花散常用于治疗一系列出血性下消化道疾病，如溃疡性结肠炎和出血性肠炎[4-5]。本研究利用DSS诱导大鼠急性试验性结肠炎，以评估槐花散水煎剂对急性试验性结肠炎的保护作用。

葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型发病机制和临床表现与人类的溃疡性结肠炎类似[6]。本试验中，大鼠接受5% DSS饮水7 d后，表现出严重腹泻，血便，被毛逆立，萎靡扎堆。结肠组织病理学检查发现，结肠黏膜上皮细胞严重脱落，隐窝结构严重破坏，伴有广泛的炎性细胞浸润。说明本试验成功建立了DSS致大鼠急性试验性结肠炎模型。为了进一步研究槐花散对结肠炎大鼠的治疗作用，本试验使用DAI判断大鼠肠炎活动性程度；通过TNF-α和IL-1β水平评估大鼠全身炎性反应程度，同时通过结肠组织病理学观察和结肠炎性因子CRP和MCP-1水平评估局部炎性反应程度，以综合判断槐花散对试验性结肠炎的有效性。

本试验发现，当槐花散给药剂量为每天5.76 g/(kg·bw)时，肠炎大鼠的DAI显著降低。给药剂量较低为2.88 g/(kg·bw)时，肠炎大鼠DAI有降低趋势，但无显著性差异。DAI结果表明，槐花散能有效降低急性期肠炎活动性。从结肠病理学观察结果来看，2.88 g/(kg·bw)、5.76 g/(kg·bw)剂量槐花散皆能有效维持结肠黏膜完整性，降低炎性细胞浸润和以及缓解肠炎大鼠结肠炎症反应。槐花散有效降低血清中炎性因子TNF-α和IL-1β的浓度，以减弱肠炎进程中的全身性炎症，保护肠炎大鼠。此外，2.88 g/(kg·bw)、5.76 g/(kg·bw)剂量槐花散能显著降低结肠CRP和MCP-1水平。肠炎进程中，CRP是炎症急性反应期重要蛋白标志物之一[7]，MCP-1在炎症反应中激活和趋化单核细胞[8]。二者的变化反映了槐花散能有效抑制结肠局部炎症，控制炎症进展。

本试验表明，槐花散能显著缓解试验性结肠炎大鼠症状，修复结肠黏膜损伤，降低血清促炎因子TNF-α和IL-1β浓度，下调结肠CRP和MCP-1水平。槐花散含有丰富的芦丁、槲皮素、山奈酚、黄芩苷等有效成分，这些成分均被证明有良好的体内体外抗炎和抗氧化效果[9-11]，这可能是槐花散发挥抗炎作用，有效治疗下消化道出血的主要原因。后续研究可针对槐花散及其主要成分的主要抗炎靶点做进一步探讨。