鸡球虫病四价五株活疫苗安全性试验

殷莉阳 ， 郑明学 ， 吕强华 ， 白 瑞 ， 张 黎 ， 康慧鑫 ， 范炳灵 ， 段步婷

(山西农业大学动物医学学院 ， 山西 太谷 030801)

鸡球虫病是由艾美耳球虫属的一种或多种球虫寄生于鸡肠道细胞引起的寄生性原虫病[1-2]。柔嫩艾美耳球虫(Emeriatenella,E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和堆型艾美耳球虫(E.acervulina)在鸡场普遍存在且对鸡的致病力强[3]，主要损伤鸡的肠道，严重者可致死，病鸡即使痊愈，其生长发育也会受到一定影响，增重缓慢，产蛋率降低[4]。据报道，全球的养鸡业每年因此遭受的损失高达30亿美元[5]。

化学药物是多数鸡场使用的一种防治鸡球虫病的方法，但其导致的耐药性、药物残留和环境污染等问题无法解决，因此要寻找一条安全高效的途径来防治鸡球虫病[6]。早熟弱毒活疫苗潜隐期短，致病力低，免疫原性得到保留，遗传性能稳定[7]，是防治鸡球虫病的最佳选择，所以本试验旨在对由E.tenella、E.necatrix、E.acervulina和E.maxima(山东株和山西株)早熟株制备的鸡球虫病四价五株活疫苗进行实验室安全性研究，为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 疫苗 鸡球虫病四价五株活疫苗(柔嫩艾美耳球虫PTSX株+毒害艾美耳球虫PNSX株+巨型艾美耳球虫PMSX株+巨型艾美耳球虫PMSD株+堆型艾美耳球虫PASX株)，每羽份含孢子化卵囊(2 700±270)个，由山西农业大学兽医病理实验室保存与提供。

1.1.2 实验动物 1日龄SPF雏鸡，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供SPF种鸡蛋孵化而来。

1.2 试验方法

1.2.1 一次单剂量接种 选40只体重相近的4日龄SPF雏鸡，随机分为一次单剂量接种组(T1、T2)和空白对照组(C1、C2)，每组10只。接种组以每只鸡1羽份的推荐免疫剂量于4日龄雏鸡进行1次接种，空白组不接种。接种后从精神、饮食、粪便、死亡数量方面每天观察鸡只并记录，第5天时记录血便记分。C1、T1组于第7天对鸡只进行空腹称重后剖检，系统全面观察心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃和三段肠道(十二指肠、空肠和盲肠)病理变化和3个肠段病变记分，取心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃和三段肠道，石蜡切片，H.E.染色，进行病理组织学检查。C2、T2组于第14天进行称重，之后处理同C1、T1组。

1.2.2 单剂量重复接种 将40只体重相近的4日龄SPF雏鸡，随机分为单剂量重复接种组(T3、T4)和空白对照组(C3、C4)，每组10只。接种组以每只鸡1羽份的推荐免疫剂量于鸡只4日龄和18日龄时各接种1次，空白组不处理。接种后临床观察方法同1.2.1项，并于二次接种后第7天和第14天分别对T3、C3组和T4、C4组鸡只空腹称重，剖检与组织学检查方法也同1.2.1项。

1.2.3 一次超剂量接种 将260只体重相近的4日龄SPF雏鸡，随机分为一次超剂量接种组(A11～A34/B11～B34)和空白对照组(C5、C6)，每组10只，共26组。A11～A34组和B11～B34组分别以3批疫苗(第1批、第2批、第3批)按推荐免疫剂量的10、20、30倍和100倍进行接种，C5、C6组不接种。接种后临床观察方法同1.2.1项，并于接种后第7天和第14天对A11～A34、C5组和B11～B34、C6组鸡只空腹称重，剖检与组织学检查方法也同1.2.1项。

1.3 检测指标 参照郭钰珏等[8]方法计算相对增重率(RWG)、死亡率，参照Johnson等[9]方法进行肠道(十二指肠、空肠和盲肠)病变记分。

1.4 数据处理 使用SPSS Statistics 22软件对试验数据进行分析，用平均数±标准误表示。

2 结果

2.1 一次单剂量接种 一次单剂量接种后鸡只表现未见异常，未见死亡。接种后第7天(T1)和第14天(T2)接种组的RWG均≥80%，各组肠道病变记分均≤1，与空白对照组无显著差异(P>0.05)，见表1。

剖检发现，接种后第7天(T1组)少数鸡只盲肠黏膜上有轻微出血点，其他肠段和组织器官无眼观病变。镜检发现，鸡只在接种第7天后十二指肠绒毛整体结构完好，只有少量上皮细胞脱落，少量虫体寄生于肠黏膜固有层内；空肠、盲肠黏膜上皮损伤轻微，结构较完整，固有层可见炎性细胞浸润，可见少数虫体寄生时的空泡和合子；接种鸡只第14天(T2组)时，十二指肠未见虫体寄生，只有少量上皮细胞呈局灶性轻微脱落；空肠、盲肠黏膜上皮无明显脱落，结构较完整，固有层内有极少数虫体寄生时的空泡和合子。空白对照组各组织器官剖检和镜检均未见眼观病变和病理变化。

表1 一次单剂量接种结果

2.2 单剂量重复接种 接种之后，各组鸡只临床症状均无异样，也没有死亡。二次接种后第7天(T3)和第14天(T4)接种组的RWG均≥80%，且T4组的RWG极显著高于T3组(P<0.01)；各接种组鸡肠道病变记分均≤1，T3组盲肠病变记分显著高于对照组(P<0.05)，其他各组各肠道与空白对照组相比病变记分无显著差异(P>0.05)，见表2。

剖检发现，二次接种后第7天(T3组)，鸡的十二指肠部位散在少量白色结节，少数鸡只空肠轻微胀气，极少数鸡只盲肠有零星出血点，其余组织器官无眼观病变。镜检发现，大部分十二指肠绒毛上皮细胞完好，只有少量的轻度脱落，有不同发育期的虫体寄生于黏膜固有层内(见中插彩版图1)，空肠黏膜上皮结构较完整，上皮细胞少量脱落，有多数大配子体和合子存在黏膜固有层(见中插彩版图2)，大部分盲肠绒毛结构完好，上皮细胞灶状脱落，固有层内有个别虫体寄生时留下的空泡和合子(见中插彩版图3)；二次接种后第14天(T4组)镜检发现鸡的十二指肠的个别绒毛不完整，有少量上皮细胞呈局灶性脱落，少量大配子体和合子存在于黏膜固有层；空肠和盲肠少量黏膜上皮细胞脱落，固有层内可见少量合子。空白对照组(C3、C4组)剖检和镜检各组织器官未见眼观病变和病理变化。

表2 单剂量重复接种结果

2.3 一次超剂量接种 接种第2天，100倍剂量接种组的鸡只几乎全部萎靡不振，食欲废绝，蜷缩扎堆，站立不稳，接种后6 d内死亡率高达80.0%；其余剂量组鸡只无死亡，未见明显异常表现。按10、20、30、100倍推荐剂量接种的鸡，随接种剂量的加大RWG逐渐降低，3个肠段病变记分逐渐升高。接种组接种后第7天(A11～A34组)与对照组(C5组)各肠道病变记分差异显著(P<0.05)，接种后第14天(B11～B34组)与对照组(C6组)各肠道病变记分差异不显著(P>0.05)，各接种组至少有8只鸡肠道病变记分≤1。

接种第7天，剖检发现，10、20、30倍剂量试验组雏鸡，除3个肠段有少量白色结节或出血点外，其他组织器官无眼观病变。100倍剂量接种组雏鸡十二指肠黏膜严重出血，有成片的白色结节；空肠明显胀气；盲肠黏膜出血严重，肠腔内含有大量血液或盲肠芯；病死鸡喙部呈黑色，嗉囊肿胀明显，内容物为饲料颗粒和大量淡黄色液体；肝脏呈土黄色且颜色不均；腺胃乳头肿胀，挤压时可见淡黄色液体流出；少数鸡只肌胃角质层轻微糜烂；肾脏被膜剥离后，可见零星出血点；其余组织器官未见眼观病变。

镜检100倍剂量接种组：十二指肠黏膜上皮少量脱落(见中插彩版图4)，有不同发育期的虫体寄生于固有层；空肠和盲肠黏膜上皮损伤较轻微，呈局部灶状脱落(见中插彩版图5、图6)，上皮和固有层内可见多量大配子体；肝细胞出现颗粒变性或水泡变性，一些细胞核溶解或浓缩坏死(见中插彩版图7)；心肌纤维发生轻度颗粒变性(见中插彩版图8)；腺胃黏膜皱襞灶状断裂，其上皮细胞变性、坏死、脱落(见中插彩版图9)；肾小管上皮细胞多数肿胀、变性，部分细胞核溶解坏死，胞浆呈空泡状(见中插彩版图10)。

镜检10、20倍和30倍剂量接种组：3个肠段上皮细胞均有少量灶状脱落，不同发育期的虫体寄生在肠黏膜上皮层和固有层内；其余组织器官未见病变。空白对照组各组织器官均未见病理变化。

3 讨论

一次单剂量接种、单剂量重复接种和10、20、30倍超剂量接种后鸡只未见明显异常表现，全部存活；剖检后肠道病理变化不明显，且所有鸡只各肠道病变记分≤1.0，其他组织器官无眼观病变。段嘉树等[10]通过组织学观察到早熟株的第2代裂殖子会变小，正是因为内生发育最后1～2代裂殖生殖的缺陷，才导致早熟株的致病性大大降低。一次单剂量接种和单剂量重复接种鸡的RWG均≥80%，超剂量接种时平均增重和RWG与接种剂量呈负相关，在一定程度上影响鸡的增重，但属于安全范围。说明该疫苗单剂量一次和重复接种及10、20、30倍超剂量接种对鸡是安全的，这和郭钰珏等的试验结果相符[8]。

100倍推荐剂量接种时雏鸡表现异常、死亡率≥80%， 剖检时肠道病变明显，其他脏器表现不同程度的病理变化。崔小珍等[11]研究表明，0.464 g/(kg·bw)以上的重铬酸钾对雏鸡的各内脏器官均有不同程度的损伤，其对雏鸡的LD50为0.501 g/(kg·bw)。剖检和镜检100倍剂量组的鸡发现其病理特性与崔小珍报道的重铬酸钾对脏器损伤的病理特性极为相似，并且100倍剂量接种的活疫苗中重铬酸钾的剂量约为0.676 g/(kg·bw)，远大于LD50，因此，造成100倍剂量组雏鸡死亡率高的原因主要是由于重铬酸钾浓度过高所致，所以不建议使用此剂量接种。