RMPP患儿血清相关炎症因子及外周血白细胞TLR-2/MyD88/NF-κB通路mRNA、蛋白表达观察

胡景伟，杨淑兰

内蒙古医科大学赤峰临床医学院，内蒙古赤峰 024000

2016年肺炎造成92万5岁以下儿童死亡，其中98%来自发展中国家，肺炎也是当前我国5岁以下儿童死亡的主要原因之一[1]。难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)是指肺炎支原体肺炎(MPP)患儿经正规大环内酯类抗生素治疗后仍持续发热，临床症状和影像学表现持续加重者，短期内可出现肺内及肺外并发症，是造成儿童患慢性气道疾病、影响生命质量的重要原因[2]。研究[2]显示，机体免疫功能紊乱引起的异常炎症反应是RMPP发生的主要机制之一。肺炎支原体(MP)细胞膜上的脂质相关膜蛋白经免疫细胞表面的Toll样受体(TLRs)识别后，在各种酶的作用下，激活丝裂原蛋白激酶以及各种转录因子，最终诱导其分泌炎症因子。TLRs是能够参与免疫反应的一类重要蛋白质分子，它们可以识别入侵的病原体，然后通过TLRs胞内区Toll/IL-1受体结构域与髓样分化因子88(MyD88)羧基端结合，再通过MyD88氨基端的死亡结构域进行信号转导，进而激活核因子κ-B(NF-κB)诱导炎症因子表达和分泌[3,4]。本研究观察了RMPP患儿血清相关炎症因子[干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-8(IL-8)、半胱氨酰白三烯(CysLTs)、单核细胞趋化蛋白4(MCP-4)]以及外周血白细胞TLR-2/MyD88/NF-κB通路基因[Toll样受体-2(TLR-2)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子-B(NF-κB)]mRNA和蛋白的改变，并探讨RMPP的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年10月～2018年10月内蒙古医科大学赤峰临床医学院收治的RMPP患儿25例(难治组)，男15例，女10例；年龄(5.94±3.46)岁。MPP患儿25例(普通组)，男9例，女16例；年龄(4.63±2.50)岁。纳入标准：①RMPP：符合MPP诊断标准，单用大环内酯类常规治疗1周后，仍表现有持续高热，咳嗽、胸痛等症状无明显改善，胸部X线片或胸部CT示病灶范围变大，出现单侧或双侧大片、高密度肺实变影，或出现中、大量胸腔积液，甚至出现坏死性肺炎或弥散性间质性肺浸润等表现[2]；②MPP：有发热和呼吸道症状，胸部X线正位片示有肺炎表现、实变阴影，血清MP特异性IgM抗体阳性。排除标准：①过敏性疾病：如荨麻疹、过敏性鼻炎、哮喘等；②免疫性疾病：系统性红斑狼疮，青少年糖尿病，类风湿性关节炎等；或近期使用糖皮质激素者；③家属拒绝。另选25例健康体检儿童作对照(对照组)，男14例，女11例；年龄(5.80±3.80)岁。本实验已通过医院伦理委员会批准同意，所有研究对象均征得监护人同意并签署知情同意书。

1.2 标本取材 取就诊时或住院第2天晨起抽取静脉血2 mL置于抗凝管中，4 ℃条件下以转速3 000 r/min速度离心10 min，分离到的血清(用于检测IFN-γ、IL-8、CysLTs、MCP-4)及白细胞(用于检测TLR-2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白)分装在无菌EP管内，-80 ℃储存。

1.3 血清IFN-γ、IL-8、CysLTs、MCP-4检测方法 采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)法检测血清中IFN-γ、IL-8、CysLTs、MCP-4，试剂盒购自南京信帆生物有限公司，具体操作步骤按说明书进行。

1.4 外周血白细胞TLR-2、MyD88、NF-κB mRNA检测方法 采用RT-PCR法。①RNA的提取：按试剂盒说明书(Thermo，15596026)步骤分离总RNA，测光密度(OD)值定量RNA浓度。②cDNA的合成：按照TaKaRa公司的PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。③PCR扩增：参照GenBank中目的基因mRNA序列设计相关引物(由南京德亨文生物科技有限公司合成)，取1 μL cDNA为模板，加入引物，放入PCR扩增仪，扩增条件如下：a.95 ℃预变性3 min；b.94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，28个循环；c.12 ℃ ∞。④电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90V电泳30 min，通过凝胶成像系统扫描电泳图像，用Image J软件对各条带OD值进行定量分析，待测基因与相应内参OD比值作为mRNA的相对表达量。

1.5 外周血白细胞TLR-2、MyD88、NF-κB蛋白检测方法 采用蛋白印迹法。①血液样本蛋白提取参考血液蛋白快速提取试剂盒(BestBio)，具体过程按说明书进行。②蛋白浓度定量：样品蛋白浓度测定通过BCA蛋白质浓度测定试剂盒完成。③电泳、转膜和孵育：每个样品总蛋白上样量均为40 μg。按照浓缩胶80 V、分离胶120 V进行恒压电泳，待蛋白分离完全，将蛋白转印到PVDF膜。在转好的膜中加入封闭液，室温下封闭60 min。加入一抗4 ℃条件下过夜，回收一抗，用TBST洗涤后再加入二抗，于室温下孵育30 min。④检测：滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，于暗室中曝光。以OD值和标准物浓度为横纵坐标绘制标准曲线，按照样品OD值获取对应样品浓度。再用稀释倍数乘以样品浓度，即可得到样品的实际浓度。

2 结果

2.1 各组血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平比较 血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平比较见表1。

表1 各组血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与普通组比较，bP<0.05。

2.2 各组外周血TLR-2、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白比较 外周血TLR-2、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白比较见表2。

表2 各组外周血TLR-2、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与普通组比较，bP<0.05。

3 讨论

MPP是儿童社区获得性肺炎的重要组成部分，MP感染属于自限性疾病，但部分MPP经正规大环内酯类抗生素治疗1周及以上，仍持续发热，临床症状和影像学表现加重者，称之为RMPP[2]。RMPP常见于年长儿，发热时间及住院时间较长，胸部影像学进行性加重，可出现胸腔积液、肺坏死及肺脓肿形成等肺部并发症。除呼吸系统外，RMPP还可以常在短时间内出现神经系统、血液系统、消化系统以及循环系统功能障碍。RMPP的发病机制尚未完全清楚，目前认为MP感染机体后导致促炎细胞因子过度释放，产生过强的组织损伤，所以免疫功能紊乱在RMPP的发病中起重要作用[2,5]。

INF-γ是先天性及获得性免疫中至关重要的促炎细胞因子，可以激活巨噬细胞，并加强巨噬细胞的吞噬作用，清除病原体。研究[6,7]发现，RMPP患儿血清中检测到了高浓度的INF-γ，可以提示组织损伤的严重性。CysLTs能够促进以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞向气道迁移，导致气道平滑肌收缩，是一种强效的致支气管收缩因子和促炎因子。Andrews等[8]发现，MP感染的患儿血中CysLTs水平高于健康对照组。IL-8在炎性反应中发挥促炎作用，可以激活中性粒细胞并趋化其迁移至炎症部位，释放多种活性产物，加重炎症反应。管敏昌等[9]认为，IL-8是RMPP炎症反应中的重要因子，在一定程度上与炎症的严重程度具有相关性。MCP-4由单核细胞及上皮细胞产生的强力趋化蛋白，也可将Th2细胞聚集至炎症部位引起免疫损伤，造成进一步损害。国内学者研究[10]表明，普通组患儿血清MCP-4水平显著高于对照组。本研究显示，难治组患儿血清中IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平明显升高，与上述研究一致。

TLRs识别入侵的病原体后募集MyD88，进而在多种蛋白激酶的作用下激活NF-κB，激活的NF-κB进入细胞核[11,12]，诱导IL-8、IFN-γ、CysLTs等多种炎症因子的合成和分泌[13,14]。目前已发现的TLRs共11种，TLR-2可以直接识别MP膜脂蛋白[15]，且TLR-2在正常人气道上皮及支气管上皮细胞中表达很低，当病原体入侵机体时表达上调。有研究[16]发现，MPP患儿血清TLR-2的表达明显增高，并与MP抗体滴度呈正相关，MP感染TLR-2缺陷的小鼠不能诱导炎性细胞因子和气道上皮黏蛋白的产生[11]；MyD88是一种重要的接头蛋白，是大部分TLRs的衔接蛋白，静息时以结合蛋白非活性的形式存在于免疫细胞中。当配体出现时，MyD88从结合蛋白中分离出来，其羧基端被激活。动物实验研究表明：MyD88基因缺陷的小鼠在肺炎衣原体感染时无法上调促炎因子和趋化因子，不能向肺部募集适当的免疫细胞清除病原体，引发慢性肺部炎症和更高的病死率。Chu等[11]发现，MP感染后的小鼠血清中TLR-2的mRNA和蛋白增加，MyD88向TLR-2的募集增加，NF-κB的活性也显著增加。NF-κB是一种广泛存在的快速作用转录因子，参与调节各种细胞反应和炎症基因的表达。NF-κB的活化是重症肺炎疾病过程的重要环节，其早期活化对病原体的清除和机体防御起重要作用，但是过度激活则会导致过强的免疫反应使病情加重病程延长。本研究显示，难治组TLR-2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表达水平均较普通组及对照组高，提示其可能在RMPP发病中发挥重要作用。

总之，RMPP患儿血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平升高，外周血TLR-2、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA表达升高。