呼吸道合胞病毒感染致毛细支气管炎患儿血清TLR4、TGF-β1水平变化观察

何月贤，宋文秀，张丽梅，谢炳龙

遵义医科大学第五附属(珠海)医院，广东珠海 519100

呼吸道合胞病毒(RSV)是导致毛细支气管炎最常见的病原体，RSV感染致毛细支气管炎病情严重程度不等，轻者经抗感染及对症治疗后缓解，严重者可致肺气肿、呼吸衰竭甚至危及患儿生命[1]。文献[2]报道，超过1/3的患儿因治疗不及时可继发为支气管哮喘、喘息等，给患儿及家庭带来沉重负担。早期诊断RSV感染致毛细支气管炎并评估病情严重性，对临床制定针对性治疗方案具有重要意义，同时也为临床预测喘息发病风险，并采取相关干预措施提供指导。RSV感染致毛细支气管炎属炎症反应性疾病，炎症细胞及其分泌的炎性细胞因子作用的炎症反应贯穿整个发病过程[3,4]。Toll样受体-4(TLR4)是由巨噬细胞、单核细胞等合成的跨膜受体蛋白，通过识别接头蛋白介导了细胞信号转导途径而激活天然免疫反应。研究[5,6]发现，TLR4信号转导通路还介导了病毒性心肌炎、哮喘等炎症疾病的发病过程。转化生长因子-β1(TGF-β1)广泛存在于哺乳动物的骨组织细胞及转化细胞中，介导了细胞增殖、分化、氧化应激、组织修复等生理过程，同时通过诱导炎性细胞因子的释放而调节炎性免疫应答[7,8]。目前，关于TLR4、TGF-β1在RSV感染致毛细支气管炎发病过程中与炎症反应的关系研究较少。本研究通过检测血清TLR4、TGF-β1，并探讨其与RSV感染致毛细支气管炎病情严重性的关系及对并发喘息的预测价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年6月～2017年6月遵义医科大学第五附属(珠海)医院收治的RSV感染致毛细支气管炎患儿121例(观察组)，男63例，女58例；年龄1个月～4岁，平均(10.32±4.16)个月；病程1～3(1.75±0.38)d。纳入标准：①患儿典型临床症状如咳嗽、喘息症状、双肺广泛喘鸣音或湿啰音，结合影像学和实验室检查等综合确诊为毛细支气管炎，并符合《诸福棠实用儿科学》(第8版)中的诊断标准[9]；②鼻咽部标本经PCR检查证实为RSV阳性；③患儿发病至入院时间≤3 d；④纳入研究前1个月未内服用过糖皮质激素、白三烯等可能影响本研究结果的药物；⑤临床资料完整，且发病后随访时间均超过2 a。排除标准：①心脏功能不全者以及肝肾功能障碍患儿；②急、慢性炎症反应性疾病患儿；③免疫性疾病患儿；④肺部畸形、先天性喉软骨发育不全等出生缺陷患儿；⑤其他类型病原体感染或者有多种病原体混合感染的患儿；⑥纳入研究前1个月内有呼吸道感染史者；⑦恶性肿瘤患儿。参照《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)》分级方案[10]将观察组患儿按照病情严重程度分级，其中轻度组59例，中度组38例，重度组24例。按照患儿发病后2年内是否继发为喘息分为两组，喘息组31例，非喘息组90例。另选50例同期健康体检儿童作对照(对照组)，男27例，女23例；年龄20 d～5岁，平均(11.85±3.63)个月。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究得到医院伦理委员会的批准，研究对象家属在知情同意书上签字。

1.2 血清TLR4、TGF-β1检测方法 收集观察组患儿入院当日、健康体检婴幼儿体检当日肘静脉血3 mL，将血液标本于室温下静置1 h，以3 000 r/min的转速离心5 min，离心半径为12 cm，留取血清置于-70 ℃冰箱中，留待检测。采用ELISA法检测血清TLR4、TGF-β1，检测仪器为芬兰雷勃Thermo Multiskan FC全自动酶标仪，TLR4试剂盒由上海研吉生物科技有限公司提供，TGF-β1试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供，操作过程严格按照试剂盒上说明进行。

2 结果

2.1 观察组和对照组血清TLR4、TGF-β1水平比较 观察组和对照组血清TLR4、TGF-β1水平比较见表1。

2.2 轻度组、中度组、重度组血清TLR4、TGF-β1水平比较 轻度组、中度组、重度组血清TLR4、TGF-β1水平比较见表2。

表1 观察组和对照组血清TLR4、TGF-β1水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2 轻度组、中度组、重度组血清TLR4、TGF-β1水平比较

注：与轻度组比较，*P<0.05，与中度组比较，#P<0.05。

2.3 观察组血清TLR4、TGF-β1水平与病情严重程度的关系 观察组血清TLR4与TGF-β1呈正相关(r=0.672，P<0.05)；血清TLR4、TGF-β1与病情严重程度呈正相关关系(rs=0.735、0.708，P均<0.05)。

2.4 喘息组和非喘息组血清TLR4、TGF-β1水平比较 喘息组和非喘息组血清TLR4、TGF-β1水平比较见表3。

表3 喘息组和非喘息组血清TLR4、TGF-β1水平比较

注：与非喘息组比较，*P<0.05。

2.5 血清TLR4、TGF-β1水平对RSV感染致毛细支气管炎患儿继发喘息的预测价值 血清TLR4水平预测RSV感染致毛细支气管炎患儿继发喘息的AUC为0.874(95%CI：0.819～0.9290)，约登指数0.69，最佳截断值为28.49 ng/mL，灵敏度为0.79，特异度为0.85，准确性为0.82；TGF-β1的AUC为0.905(95%CI：0.859～0.952)，约登指数为0.73，最佳截断值为30.76 ng/mL，灵敏度为0.82，特异度为0.88，准确性为0.86；TLR4联合TGF-β1的AUC为0.925(95%CI：0.886～0.965)，约登陆指数为0.78,灵敏度为0.87，特异度为0.93，准确性为0.89(详见图1)。

3 讨论

RSV为单链RNA病毒，是引起婴幼儿毛细支气管炎最常见的病原体，由于婴幼儿的免疫系统尚未发育完善，极易多次反复感染，损伤肺功能，且患儿继发喘息风险远高于普通儿童[11]。RSV感染致毛细支气管炎病理改变包括毛细支气管黏膜出现水肿且分泌量显著增加，同时伴有上皮细胞脱落堵塞管腔，临床症状主要有喘息、咳嗽、气急以及低氧血症等，患儿病情进展迅速，治疗不及时可危及患儿生命[12,13]。早期诊断及治疗RSV感染致毛细支气管炎，并尽可能降低喘息发生风险是临床关注的重点。

图1 血清TLR4、TGF-β1预测RSV感染致毛细支气管炎患儿继发喘息的ROC曲线

研究[14]表明，免疫功能失调、炎性细胞及其分泌的炎症因子等介导了RSV感染致毛细支气管炎发病过程。TLRs是在天然免疫反应中发挥重要作用的受体家族，在识别不同的接头蛋白后可介导信号途径而参与不同的免疫反应，TLR4是属于TLRs家族成员的I型跨膜蛋白，主要在细胞内或者细胞表面表达。研究[15]显示，TLR4通过特异度识别病原体细胞外的亮氨酸重复序列而将信号传导至细胞内发挥免疫应答反应，最终发挥抗病毒作用。刘冬云等[16]证实，TLR4表达上调通过与热休克蛋白结合可增加细胞内钙离子浓度，促进肿瘤坏死因子以及IL-6的合成，引起血管收缩和血压升高，增加血管阻力损伤血管，同时还可促进血管平滑肌增殖，引起血管重构，损伤靶器官。冯等[17]发现，血红素可使TLR4的MyD88/TRIF信号激活，进而促进炎症反应发生。TGF-β1是广泛存在于嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞、巨噬细胞等各种细胞中的促炎因子，通过介导免疫炎症反应参与气道疾病的发生发展过程[18]。研究[19]显示，RSV感染后使无活性的TGF-β1激活并转变成有活性TGF-β1，并进一步激活TGF-β1Ⅰ型及Ⅱ型受体，通过磷酸化作用激活依赖Smad信号通路并与CoSmad及Smad4结合，形成异源四聚体复合物进入到细胞核中，通过调控基因转录介导Th/Treg细胞所致的免疫反应。Wang等[20]认为，TGF-β1通过激活并趋化炎症细胞因子而在喘息中发挥免疫炎症反应。于永鹏[21]发现，TGF-β1通过介导氧化应激及炎症反应导致神经元变性，进而参与帕金森病的发病过程。

本研究显示，观察组TLR4、TGF-β1水平高于对照组，并由此推断TLR4、TGF-β1参与了RSV感染致毛细支气管炎的发病过程，可能的机制是RSV感染后其包膜融合蛋白与宿主细胞融合并形成融合体，引起毛细支气管分泌有活性的模式识别受体TLR4，进而介导天然免疫应答反应以增加呼吸道对入侵病原体的敏感性，以达到清除病原体的效果[22]；RSV感染毛细支气管后，促使炎症细胞释放大量炎性细胞因子而发生炎症反应，与此同时炎症反应还促使内皮细胞、巨噬细胞等多种细胞释放促炎因子TGF-β1，TGF-β1在依赖Smads蛋白的信号转导及调控下，诱导Treg/Th17比例失衡，加重RSV感染致毛细支气管炎。本文结果还显示，随着病情逐步加重，血清TLR4、TGF-β1逐渐升高，提示两指标可反映RSV感染致毛细支气管炎病情严重性，早期检测可辅助临床评估病情严重程度，从而指导临床制定针对性干预方案改善患儿病情。而RSV感染致毛细支气管炎患儿血清TLR4与TGF-β1呈正相关，提示两指标可能通过协同作用促进病情发生及进展，但机制有待进一步探讨。本研究还显示，血清TLR4、TGF-β1与病程严重程度呈正相关，可能是因为TLR4与TGF-β1水平越高说明患儿免疫应答反应及炎症反应越严重，病情也不断加重。RSV感染致毛细支气管炎患儿治疗不及时可继发为喘息，加重患儿病情，预后较差。本研究结果显示，继发喘息的患儿血清TLR4、TGF-β1水平更高，两指标对继发哮喘具有一定的预测价值，并且联合检测预测价值更高。提示患儿入院时尽快检测血清TLR4和TGF-β1，可作为预测继发喘息发生风险的生化指标。

总之，血清TLR4、TGF-β1表达上调通过介导免疫应答反应和炎症反应而参与RSV感染致毛细支气管炎发病过程，并与病情严重性密切相关，早期联合检测可作为预测患儿继发喘息发生风险的潜在靶向指标，从而指导临床实践。