黄芩苷对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的调控作用

郑小鹏，冯 静，宋朝宇，王芳芳，张慧明，隋洪玉，辛 华，陈 光

0 引 言

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种高发病率和高死亡率的终生代谢性疾病，急/慢性并发症的出现降低了患者的生活质量[1-2]。糖尿病肾病(diabetic Nephropathy，DN)作为DM严重的慢性微血管并发症之一，发生过程十分隐匿，临床诊断只能依据大量蛋白尿，一旦发现蛋白尿肾损坏往往比较严重且不可逆转，最终只能通过肾替代治疗来延续生命[3-4]。开展DN发病机制及防治措施的研究不仅是国际医学研究的热点，而且也是我国肾病领域丞待解决的难题。目前，临床中对于DN的治疗尚无特效疗法[5-6]，寻找有效的治疗策略迫在眉睫。为此科研工作者将肾的中药治疗作为当今临床治疗肾疾病的突破点。

黄芩属唇形科植物，含有多种黄酮类化合物[7]。黄芩苷是黄芩中一种重要的黄酮类化合物，具有清热解毒、抗炎、抗氧化作用、在治疗肿瘤以及免疫调节许多方面都有很好疗效[8-9]。近年来，黄芩苷在降血糖血脂、改善代谢综合征方面的作用受到广泛关注，特别是在DN的治疗方面展现了更好的应用前景[10-11]。本实验使用黄芩苷灌胃DN大鼠，旨在研究探讨黄芩苷的抗纤维化作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性清洁级SD大鼠45只，体重180～220 g，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，实动物许可证号SYXK(黑)2016-014)黄芩苷购于源叶生物；链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司；柠檬酸钠和柠檬酸购于武汉博士德生物技术公司；血糖仪与血糖试纸购自三诺生物传感股份有限公司；转化生长因子-β1(transforming growthfactor β1，TGF-β1)抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司；α-SMA抗体购于北京博奥森公司；β-actin抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；PAS染色试剂盒购于Solarbio公司；Masson染色试剂盒购于Solarbio公司；全自动生化分析仪(Beckman coulter)；曝光机(Tanon-5200Multi)；希森美康尿液分析仪(UF-1000i)；显微镜(Leica DM4000B)。

1.2 方法

1.2.1 分组造模与给药 本次实验大鼠在佳木斯大学实验动物中心饲养，SPF级饲养环境，环境温度为(24±1)℃，相对湿度55%±10%，自由进食、饮水。采用简单随机化分组将45只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、黄芩苷处理组，各15只。正常组不予处理，模型组与黄芩苷处理组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg。72 h后尾静脉采血，血糖仪检测大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)值(禁食 ≥8 h)，按照连续3 d检测的大鼠空腹状态下血糖值均≥16.7 mmol/L为标准，可确定DM造模成功，自DM造模成功起，对照组正常饮食，其他组大鼠均给予高脂高糖饮食，黄芩苷处理组给予黄芩苷160 mg/kg/d(黄芩苷纯度≥98%，使用三蒸水进行稀释)灌胃，正常对照组与模型组给予等剂量等渗盐水灌胃，于第4周、第8周代谢笼收集尿液进行尿常规检测，结果为阳性可判断DN大鼠模型构建成功(参照药理实验方法学第四版)，8周后处死。

1.2.2 一般指标检测 所有大鼠每周固定时间称重，尾静脉采血使用血糖仪进行血糖监测。第4周，第8周将大鼠转入代谢笼中，不禁食不禁水，收集尿液进行尿常规检测。正常记录各组大鼠饮食和饮水量，随时观察其精神状态及毛色变化，每周固定时间监测血糖/体重变化。采用尾静脉穿刺采血法取血，血糖检测仪测定大鼠血糖值变化。

1.2.3 肾功能检测 各组大鼠眼球取血，分离血清，4 ℃离心(离心半径40 cm，3000 r/min，15 min)，经全自动生化分析仪进行血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)的生化指标检测。第8周于代谢笼中收集各组大鼠尿液进行尿常规检测。

1.2.4 肾组织病理学检测 所有大鼠第8周末处死取材，大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg) 麻醉，取部分肾组织置于10%中性甲醛中固定，大鼠肾组织包埋切片，分别进行HE染色，PAS及Masson染色。400倍镜下随机挑取3张图片进行肾组织病理学观察；另一部分肾组织冻存于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot相关蛋白检测。

1.2.5 HE染色 取材组织块，常规固定，包埋，切片，脱蜡水洗2 min后苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇分色30 s，自来水浸泡15 min，置伊红液中2 min，常规脱水，透明，封固，显微镜观察并照相。观察各组大鼠肾基本病理改变和炎性反应情况。

1.2.6 Masson染色 取组织切片，常规脱蜡至水后用配制好的 Weigert 铁苏木精染色液(24 h之内使用)染核7 min，酸性乙醇分化液分化10 s，水洗，Masson蓝化液返蓝3 min，水洗。三蒸水洗1 min。丽春红品红染色液染色8 min，磷钼酸溶液洗90 s，用配置好的弱酸工作液洗1 min。苯胺蓝染色液中浸泡80 s。弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脱水。无水乙醇脱水5 min×3次，二甲苯透明10 min×3次。中性树脂封固。显微镜观察并照相，观察各组大鼠肾纤维化程度。

1.2.7 PAS染色 常规固定，常采用 10%的福尔马林，常规脱水包埋。石蜡切片脱蜡入蒸馏水；自来水冲洗3 min，再用三蒸水浸洗5 min×2次。 置于氧化剂中，室温(25～30 ℃)放置7 min，自来水冲洗2 min，三蒸水浸洗5 min。切片放入Schiff Reagent中，于室温中用锡纸避光浸染15 min。自来水冲洗10 min。 样本置于苏木精染色液中，染细胞核90 s。酸性分化液分化5 s。三蒸水冲洗15 min使其返蓝，逐级常规乙醇脱水。二甲苯透明，中性树脂封固。显微镜观察并照相，观察肾小球系膜基质及胶原纤维含量。

1.2.8 Western blot检测 取50 mg肾组织，加入裂解液，蛋白酶抑制剂(PMSF)于研磨器中，均匀研磨后转入1.5 mL离心管中，超声破碎7 s×3次后冰浴30 min，4 ℃离心15 min(补充离心半径14 000 r/min)。取上清液，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白样品与5×Loading Buffer 1∶4混匀后煮沸10 min，冻存于-20 ℃冰箱备用。蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转膜至PVDF膜(PVDF膜甲醇浸泡10 s激活)，5%脱脂奶粉37 ℃封闭90 min，加一抗(TGF-β1，β-Actin，α-SMA浓度为1∶1000)，4 ℃过夜。次日，TBST洗膜5 min/4次，加入辣根过氧化物酶标记二抗 (1∶7000) ，室温摇床30 min后37 ℃孵育1 h，TBST洗膜4次/5 min。化学发光试剂ECL显影，曝光。Tanon Gis对其进行吸光度分析。以所测得的各指标的吸光度与内参β-actin吸光度的比值代表定量值。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察 与正常组对照组大鼠相比，模型组大鼠精神萎靡，不喜运动，毛色黄无光泽，饮食/水量明显增加；与模型组相比，黄芩苷处理4周后，上述情况有所改善，治疗8周后整体状况明显好转。实验全部时间内，正常组大鼠全部存活，造模后第2周模型组大鼠死亡1只，第3周死亡1只；黄芩苷处理组第2周死亡1只。

2.2 各种大鼠FBG和体重比较 与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠空腹血糖在造模后4、8周明显升高，而体重降低(P<0.05)；与模型组相比，黄芩苷治疗组大鼠在造模后4、8周血糖明显下降(P<0.05)，体重无明显改善(P>0.05)。见表1。

项目nFBG(mmol/L)造模4周造模8周体重(g)造模4周造模8周正常对照组156.20±1.067.44±1.08521.14±36.56522.00±38.98模型组1324.49±1.76*30.40±2.98*287.22±83.05*307.44±80.76*黄芩苷组1419.62±2.82*#22.03±1.70*#281.78±47.96*334.44±77.53*

与正常对照组相比，*P<0.05，与模型组相比，#P<0.05

2.3 各组大鼠肾功能比较 与正常对照组大鼠BUN、Scr、24 h尿量相比，模型组大鼠明显升高(P<0.05)；与模型组大鼠相比，黄芩苷处理组大鼠的BUN和Scr水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

组别nBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)24 h尿量(mL)尿蛋白正常对照组158.01±0.9224.15±3.2410.78±1.24(-)模型组1316.97±3.63*52.58±2.33*32.65±2.69*(+)黄芩苷组1412.73±0.67*#43.77±1.73*#19.34±2.16*#(±)

与正常对照组相比，*P<0.05，与模型组相比，#P<0.05

2.4 肾组织形态学观察 各染色结果显示，正常组大鼠肾组织结构基本正常，无病理学改变；HE染色结果显示模型组大鼠肾小球体积增大，系膜区增宽，炎细胞浸润；PAS染色结果显示，肾小球系膜增生，呈紫红色，肾小球基质内有大量染成紫红色的糖原物质沉积；Masson染色结果显示，肾小球染色偏蓝，肾纤维化严重。黄芩苷处理后肾的组织形态学改变均明显改善。见图1。

2.5 Western blot检测 与正常组大鼠相比，模型组大鼠的TGF-β1和α-SMA蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组大鼠相比，黄芩苷处理组大鼠的TGF-β1与α-SMA的蛋白表达水平明显下降 (P<0.05)，见图2。

图 1 镜下观察大鼠肾组织病理变化( ×400)

Figure 1 HE, PAS, Masson staining to observe the pathological changes of rat kidney( ×400)

1:正常组； 2：模型组； 3：黄芩苷组

a:Western blot检测; b:TGF-β1蛋白表达量; c:α-SMA蛋白表达量

与正常组相比，*P<0.05，与模型组相比，#P<0.05

图 2 黄芩苷处理降低糖尿病肾病大鼠TGF-β1与α-SMA的表达

Figure 2 Baicalin treatment reduced TGF-β1and α-SMA expression in rats with diabetic nephropathy

3 讨 论

DN既是DM最常见而严重的慢性微血管并发症，又是其主要的致死原因之一。目前国内临床上无有效的治疗方案。因此寻找高效低毒药物及有效治疗策略尤为重要。目前的研究发现，黄芩苷具有抗氧化、降低炎症反应等作用，尤其在DN的治疗方面具有极高的应用价值。因此本研究目的是通过黄芩苷处理DN大鼠，检测其对糖尿病肾病肾损伤的干预作用，旨在为糖尿病肾病的有效治疗提供新的理论和实验依据。所有慢性肾疾病发展的必然结局就是肾间质纤维化，最终导致终末期肾功能衰竭[12-13]。。然而，相关文献报道，黄芩苷能抑制不同组织器官纤维化的发生和发展，主要作用机制包括够抑制促纤维因子表达、抑制纤维化信号通路、抗炎、抗氧化等，是一种具有开发潜力的多组织器官抗纤维化药物[14]。

随着研究的不断深入，Yang 等[15]发现，黄芩苷对DN患者有着较好的治疗效果，可通过下调24 h尿白蛋白、β2微球蛋白，降低血管通透性以改变DN患者的肾功能，通过抗炎、抗氧化等途径延缓DN的进展。黄芩苷是否通过其他机制保护肾还有待进一步研究。为此，本实验采用黄芩苷处理DN大鼠后首先对比了各组大鼠的一般状态、体重、空腹血糖值、血尿氮素(BUN)水平、血肌酐(Scr)水平和24 h尿量。实验结果证明，与模型组大鼠相比，黄芩苷处理组大鼠一般状况有明显改善，空腹血糖、BUN、Scr以及24 h尿量均明显下降，但体重并无明显改善。高血糖作为引起糖尿病肾病的重要始动因素，在糖尿病肾病的发生发展中通过多种途径发挥作用，黄芩苷的降血糖作用对于糖尿病肾病的治疗有着重要作用。这与刘洋[16]等的研究结果一致。病理组织学观察发现，DN组大鼠炎性病变，糖原沉积以及肾纤维化程度严重，黄芩苷的处理对这些病理改变有明显的改善作用。

TGF-β1作为业界公认的具有强致纤维化作用的重要因子，在DN发生过程中可通过多种途径(包括自分泌与旁分泌)促使肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞，加速肾小管间质纤维化[17-18]，α-SMA作为细胞骨架的主要成分，其在纤维化的诊断与鉴别诊断中具有重要意义。有研究发现α-SMA高表达于DN大鼠肾组织，可作为纤维化检测指标[19]。Western blot结果发现：黄芩苷的处理可降低DN组大鼠TGF-β1与α-SMA的蛋白表达，结果表明黄芩苷对DN大鼠肾功能及肾纤维化有明显的改善作用。

综上所述，本实验通过建立DN大鼠模型，证实了黄芩苷对DN大鼠的肾保护作用，其作用机制可能与黄芩苷通过低调节TGF-β1的水平从而降低α-SMA的蛋白表达相关，本研究为DN的治疗提供了新的理论依据，同时也为黄芩苷的临床应用开辟了新的领域。