人源性RUNX相关转录因子1在肾癌中的表达及生物学功能

蔡 波,邢钱伟，吴 优，管杨波，郭 新

0 引 言

肾癌是临床常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，在我国位居泌尿系肿瘤第二位[1-2]，近年来其发病率呈上升趋势。肾癌起病隐匿，往往缺乏早期临床表现[3]。尽管由于诊断技术的改善使偶发性肾癌的诊断率提高，依然有25%～30%的肾癌患者在确诊时已出现远处转移[4]。而晚期转移患者治疗疗效不够理想，且严重影响着患者生活质量。目前肾癌的发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、肥胖、吸烟、高血压等因素相关。因此深入探究肾癌发生进展的机制，寻找临床更有效的生物标志物和治疗靶标对肾癌的早期诊断和治疗显得尤为重要。

人源性RUNX相关转录因子1 (runt-related transcription factor 1，RUNX1)基因属于RUNX转录调控家族成员之一，也称为AML1，是造血功能的主调控基因[5-6]。它不仅是控制造血干细胞产生的基本转录因子，而且是调控造血干细胞分化产生骨髓细胞和淋巴细胞的关键转录因子。既往研究报道RUNX1在人急性淋巴瘤、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌及甲状腺瘤等多种肿瘤中发挥重要作用[7-10]，但RUNX1在人肾癌中的作用报道较少。因此本研究研究旨在研究RUNX1基因在肾癌中的表达及生物学功能。

1 资料与方法

1.1 基因芯片数据 从GEO数据库下载GSE66272肾癌芯片原始CEL文件，包括26份肾癌患者组织样本和26份癌旁组织样本。利用R软件读取原始文件后，使用Affy包中的RMA算法标准化数据后得到基因的表达矩阵，将预处理后得到的基因表达矩阵文件用R软件读入，利用R 软件中limma 包对肾癌组织样本和癌旁组织样本基因进行差异表达分析，并且应用贝叶斯检验方法进行多重检验校正。差异基因鉴定标准：表达值倍数变化(fold change, FC)≥ 2 或< - 2，P<0.01。

1.2 组织标本与细胞 选取2015年1月至2019年6月南通大学附属医院泌尿外科20份肾癌患者组织标本，另取对应癌旁组织标本。其中男12例，女8例，42～84岁，平均年龄(58.30±7.26)岁，肾癌细胞株786-O及正常化肾小管细胞HK2购自ATCC，采用1640培养基培养(购自Hyclone公司)，胎牛血清购中国四季青公司。本研究经过医院伦理委员会批准(批准号：2019003)，患者均签署知情同意书。

1.3 肾癌细胞株转染实验 在786-O细胞中敲低RUNX1基因。RUNX1 -target具体的小干扰RNA(siRNA)由吉凯基因(中国，上海)合成。RUNX1-靶特异性siRNA (si-RUNX1)的有义序列如下：siRNA1, 5′- CCAGGTTGCAAGATTTAAT-3′； siRNA2，5′-CUCCGUACATUCGGAUAGUAT-3′; siRNA3, 5′- GGCAGAAACTAGATGATCA-3′，对照 序列为5′- CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′。对数生长期的786-O细胞接种于6孔板，待细胞密度融合为约60%时将细胞分为：siRNA1组(转染si-RUNX1的siRNA1序列)、siRNA2组(转染si-RUNX1的siRNA2序列)、siRNA3组(转染si-RUNX1的siRNA3序列)、对照组(对照序列空载体siRNA转染)。3个RUNX1小干扰RNA转染786-O细胞，培养48 h后，提取RNA分别检测siRNA的敲减效率。

1.4 实时定量PCR测定RUNX1含量 采用试剂盒提取肾癌组织及癌旁正常组织中的总RNA，用RT-PCR法测定各组RUNX1表达量，内参使用GAPDH进行标准化。

1.5 细胞克隆形成实验 取各组转染的786-O细胞，制备单细胞悬液，以800/孔接种于6孔板，细胞培养箱温育静置培养2周时间，待细胞克隆形成，终止培养，使用4%多聚甲醛固定克隆细胞，0.1%结晶紫对细胞群落进行染色， 统计细胞克隆形成数量。

1.6 MTT法检测786-O细胞增殖活性 取各组转染的786-O细胞，以3000/孔接种于96孔板培养，实验结束前在每个孔中加入20 μL MTT在37 ℃孵育4 h弃培养液，各孔再加入DMSO 150 μL，室温振荡10 min。通过酶标仪测量490 nm处的吸光度。

1.7 Transwell 肿瘤细胞侵袭实验 消化转染后的对数生长期细胞，制备单细胞悬液，离心后用不含血清的培养液重悬细胞计数，然后在24孔板中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培养液，取Transwell小室置于24孔板，在小室中加入200 μL细胞浓度为3×105/mL的细胞悬液，培养24 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫进行染色。显微镜下采集图像，计数迁移细胞，进行侵袭迁移细胞数量统计分析。

1.8 Western blot检测蛋白水平变化 取各组转染后的细胞，RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，用BCA法检测细胞蛋白浓度，取蛋白样品与5×上样缓冲液以4∶1 的比例混匀后，水浴锅100 ℃反应5 min。统一上样量，SDS-PAGE凝胶电泳90 min，Bio-Rad装置湿转蛋白于PVDF膜上，17 mA转膜过夜，切取含目的条带的PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。孵育RUNX1、E-cadherin、N-cadherin、MMP9、t-AKT、p-AKT、t-GSK3β及p-GSK3β一抗抗体(美国abcom公司，1∶1000)与GAPDH 内参抗体(美国abcom公司，1∶1000)4 ℃过夜，TBST洗膜5 min×3次，室温孵育二抗(1∶10 000)2 h，再用TBST洗膜5 min×3次，ECL显影。

2 结 果

2.1 GEO基因芯片分析及RUNX1对肾癌患者生存预后影响 筛选出971个差异表达基因，其中上调基因493个，下调基因 478个。热图及火山图显示，RUNX1在肾癌细胞样本中明显上调，提示RUNX1在肾癌中高表达，其可能与肾癌的发生发展相关。TCGA肿瘤数据库显示，RUNX1基因高表达患者总生存率及无病生存率较RUNX1基因低表达者明显降低(P<0.01)。 见图1。

a：热图；b:火山图；c：总生存率；d：无病生存率

图 1 GEO基因芯片分析及RUNX1对肾癌患者预后影响

Figure 1 GEO gene chip analysis and RUNX1 effect on the prognosis of patients with renal cancer

2.2RUNX1在肾癌及癌旁组织中的表达 GEPIA数据库分析显示，RUNX1在肾癌组织中的表达水平(1.95±0.09)显著高于癌旁组织(0.62±0.05)，且II、III级肿瘤中RUNX1表达水平明显比I级高(P<0.01)。RUNX1在肾癌细胞株(769P、A498、CAKI-1、786-O)较HK2表达升高(P<0.001)，且786-O细胞系表达量最高。因此后续实验采用786-O细胞系。见图2。

与HK2比较，*P<0.05

图 2RUNX1在肾癌中的表达

Figure 2 RUNX1 is overexpressed in renal cancer

2.3RUNX1质粒转染786-O细胞后siRNA敲减效率比较 siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组的siRNA敲减效率显著低于对照组(P<0.01)。其中siRNA1的敲减效果最佳，后续实验采用siRNA1检测。见图3。

与对照组比较，*P<0.05

图 3RUNX1小干扰RNA转染786-O细胞后敲减效果

Figure 3 The knockdown effect of RUNX1 small interfering RNA in 786-O cells

2.4RUNX1对 786-O细胞增殖活性影响 MTT检测结果显示，siRNA1组显著抑制786-O肾癌细胞的增殖(P<0.01)，见图4。克隆形成结果同样显示，与对照组比较，siRNA1组786-O肾癌细胞的集落形成效率显着降低(P<0.003)。

与对照组比较，*P<0.05

图 4RUNX1基因敲低对786-O细胞活力的影响

Figure 4 RUNX1 gene knockdown reduces viability of 786-O cells

2.5 转染后肾癌细胞的体外迁移能力transwell实验结果 siRNA1组的细胞过膜数量[(98.67±3.53)个/视野]明显低于对照组[(143.3±8.74)个/视野]，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。Western blot 结果显示，siRNA1组RUNX1、N-cadherin、MMP9、p-AKT及p-GSK3β较对照组明显下降，E-cadherin明显增加。说明RUNX1可能通过AKT通路促进肾癌细胞的迁移。见图6。

a:对照组； b:siRNA1组

图 5RUNX1敲减后AKT通路对786-O肾癌细胞迁移能力的影响(结晶紫染色 ×100)

Figure 5 RUNX1 knockdown inhibits migration of 786-O cells (crystal violet staining ×100)

图 6RUNX1敲减后AKT通路对786-O肾癌细胞迁移能力的影响

Figure 6 RUNX1 knockdown inhibits migration of 786-O cells

3 讨 论

既往研究显示RUNX1作为RUNX转录因子家族中的一员，在多种肿瘤中发挥重要作用。Keita及Eldholm等[11-12]关于卵巢癌的研究表明RUNX1在卵巢癌组织中高表达，促进卵巢癌细胞增殖，迁移和侵袭，发挥致癌基因的作用。 在食管癌的研究中发现RUNX1作为LincRNAuc002yug.2的下游调控基因促进食管癌细胞细胞增殖和肿瘤生长[13]。在乳腺癌中RUNX1既可以发挥致癌作用，也可以发挥肿瘤抑制因子的作用[14]。RUNX1缺失促进雌激素受体阳性乳腺癌上皮细胞的生长和干细胞性，但在雌激素受体阴性的乳腺癌上皮细胞系中RUNX1缺失发挥肿瘤抑制因子的作用[15-16]。RUNX1在胃癌中也扮演着致癌抑癌的双重角色[17-19]。RUNX1相关生物功能机制研究显示，其可能通过EMT通路途径从而影响肿瘤细胞的侵袭迁移[13-15]。然而RUNX1在肾癌的发生发展中的作用机制目前尚不清楚。

本研究利用GEO数据库芯片发现RUNX1在肾癌组织中表达量明显高于癌旁正常组织，进一步分析TCGA 数据库分析显示，高RUNX1表达患者预后较低RUNX1表达患者预后差，GEPIA数据库基因芯片数据进一步验证了以上结果。收集本院肾癌及癌旁组织标本，并提取标本的RUNX1表达量进行分析。研究结果发现RUNX1在肾癌组织中表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)，提示RUNX1的表达可能与肾癌的发生发展相关。因此，RUNX1在肾癌中表达上调，可能作为原癌基因参与肾癌的肿瘤形成及进展。

为进一步确定RUNX1是否作为功能性的原癌基因参与肾癌进展，本研究检测RUNX1对肾癌细胞增殖和迁移的影响。成功使用RUNX1 siRNA转染786-O细胞株，并进一步对转染细胞进行了MTT、克隆形成实验及transwell实验。MTT实验结果显示RUNX1 siRNA转染显著抑制肾癌细胞的增殖，克隆形成实验同样表明，与对照组相比，RUNX1 siRNA转染中的肾癌细胞786-O的集落形成效率显着降低。Transwell实验结果显示与对照组细胞过膜数量相比，siRNA1组的细胞过膜数量减少，差异有统计学意义。蛋白免疫印迹试验结果显示si-RUNX1组促进肿瘤细胞迁移相关的蛋白N-cadherin明显下降，E-cadherin明显增加,蛋白水平验证了RUNX1的表达水平确与肾癌细胞的迁移能力相关，RUNX1可能通过EMT途径促进肾癌细胞的侵袭迁移，进一步通路蛋白结果显示RUNX1基因下调后AKT通路关键功能蛋白p-AKT及p-GSK3β明显下调，说明RUNX1可能通过AKT通路促进肾癌细胞的侵袭迁移。

综上所述，本研究结果显示肾癌组织中RUNX1的表达水平较癌旁正常组织高表达，并且敲减RUNX1表达可以抑制肾癌细胞的增殖转移，提示RUNX1对肾癌的发生发展发挥重要作用，并且与肾癌的增殖转移密切相关，其可作为肾癌的潜在临床诊治靶点及预后标志物。