龟甲胶原蛋白的提取工艺研究

张百刚，梁海荣，冯再平，鹿琪坤，李金亮

(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050)

乌龟(Chinemysreevesii)是我国的传统物种，故国外有关研究很少，杨文鸽等[1]研究表明，乌龟的水分、总糖、总灰分、蛋白质、氨基酸以及脂肪酸等营养成分含量极高。龟甲(Carapax et Plustrum Testudinis)为龟科动物乌龟的背甲及腹甲[2]。龟甲具有丰富的活性物质，如多酚类物质、矿物质元素、甾体类、羟脯氨酸、脂肪酸等[3]。龟甲有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心的药理功效，用于治疗阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目眩、虚风内动、筋骨痿软和心虚健忘等症状[2]。我国食用乌龟者大多弃甲而食，造成了极大的浪费且污染环境。因此，本研究以废弃龟甲为原料，提取其胶原蛋白，为龟甲的综合利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

龟甲收集于农贸市场。试剂：胃蛋白酶、乙酸乙酯、硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、85%磷酸、均为分析纯。

FA2104型电子分析天平，美国UniVersal低温高速离心机，HH-S数显恒温水浴锅，UV-9200型紫外可见光分光光度计，日本岛津真空冷冻干燥机，真空干燥箱，凯氏定氮仪。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程 工艺流程：龟甲→洗净→烘干→粉碎→烘干→脱脂→酶解→离心→冷冻干燥→称重→测蛋白含量[4]。

操作要点：使用乙酸乙酯脱脂，胃蛋白酶酶解，离心条件为8000 r/min下离心15 min、弃沉淀，冷冻干燥48 h,并测定蛋白质含量，按照公式计算蛋白质的提取率。

蛋白提取率/%=[冻干胶原蛋白总含量(g/g)×冻干粗品质量(g)×100%]/初始龟甲粉质量(g)

1.2.2 试验内容

1.2.2.1 脂肪含量的测定 索氏抽提法脱脂：参考国家标准GB 5009.6─2016。

1.2.2.2 蛋白质含量的测定 (1)凯氏定氮法：参考国家标准GB 5009.5─2016；(2)考马斯亮蓝法：具体步骤参考文献[5],绘制标准曲线参照文献[6],代入下面公式得到样品蛋白质含量。

样品蛋白质含量/(g/g)=样品蛋白质浓度(mg/mL)×提取液的总体积(mL)/样品干重(mg)

1.2.2.3 脱脂时间确定 准确称取10 g龟甲粉加入100 mL的锥形瓶中，再加入50 mL的乙酸乙酯，摇匀，在通风处进行，分别放置3、4、5、6、7、8 h，测定龟甲粉中的脂肪含量，并记录数据。

1.2.2.4 单因素试验 (1)pH值对胶原蛋白初步提取的影响：准确称取脱脂后的龟甲粉1 g若干份，在酶用量4%、底物浓度6%、酶解温度37 ℃、酶解时间4 h的条件下，pH值分别为1.0、1.5、2.0、2.5的条件下处理龟甲，在8000 r/min下离心15 min，弃沉淀，用凯氏定氮法测定总氮含量，乘以蛋白系数计算胶原蛋白的含量，探讨了不同pH值对胶原蛋白初步提取的影响。

(2)酶用量对胶原蛋白初步提取的影响：准确称取脱脂后的龟甲粉1 g若干份，分别选用酶用量为3%、4%、5%、6%的条件下处理龟甲，其余条件同上，研究酶用量对胶原蛋白提取率的影响。

(3)温度对胶原蛋白初步提取的影响：准确称取脱脂后的龟甲粉1 g若干份，分别选用酶解温度为32、37、42、47 ℃的条件下处理龟甲，其余条件同上，研究酶解温度对胶原蛋白提取率的影响。

(4)时间对胶原蛋白初步提取的影响：准确称取脱脂后的龟甲粉1 g若干份，分别选用酶解时间为3、4、5、6 h的条件下处理龟甲，其余条件同上，研究酶解时间对胶原蛋白提取率的影响。

1.2.2.5 响应面试验设计 运用Box-Behnken Design设计原理，在单因素试验的基础上，取酶用量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)等3个因素，以胶原蛋白的含量为响应值，设计3因素3水平的中心组合试验，试验因素与水平设计见表2。

1.2.2.6 数据分析 每个样品做3个平行，用Excel 2007软件将数据处理并求出平均值和标准误差。用Design expert 10软件进行响应面的数据分析。

2 结果与分析

2.1 脱脂时间的确定

未脱脂之前，测得龟甲粉中的可溶性物质含量大约为45.63%。由图1可知，随着脱脂时间的变长，龟甲中的脂肪含量越来越少，脱脂时间达到6 h，龟甲中的脂肪含量最低，再增加脱脂时间，则龟甲中的脂肪含量几乎不变，且稳定在1.40%左右。根据资料显示，脂肪的存在，会干扰胶原蛋白的提取，为了有效地进行试验，最佳脱脂时间确定为6 h。

图1 龟甲中脂肪含量的变化

图2 酶解pH值对胶原蛋白含量的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 酶解pH值对胶原蛋白提取量的影响 由图2可知，随着酶解pH值增大，胶原蛋白的含量也在逐渐增大，当酶解pH值增大到1.5时，此时的胶原蛋白含量出现最高值，当再增大其酶解pH值时，胶原蛋白含量出现下降的趋势。pH值过高过低都会影响酶活性，故将pH值1.5确定为胃蛋白酶的最佳酶解时间。

2.2.2 酶用量对龟甲胶原蛋白提取量的影响 由图3可知，随着酶用量的升高，胶原蛋白的含量也在慢慢增大，当酶用量增大到4%时，此时的胶原蛋白含量出现最高值，当再增大其酶用量值时，其胶原蛋白含量呈现先不变再快速下降的趋势，故将酶用量4%确定为胃蛋白酶的最佳酶用量。

其原因是酶作为一种生物催化剂，对底物的催化能力存在一定的饱和度，刚开始是随着酶与底物的结合是趋于饱和的，因此胶原蛋白的含量会增加，当酶用量达到一定饱和值时，这时过多的酶会将龟甲中的胶原蛋白溶解，反而使胶原蛋白含量下降[7]。

图3 酶用量对胶原蛋白含量的影响

图4 酶解温度对胶原蛋白含量的影响

2.2.3 酶解温度对龟甲胶原蛋白提取量的影响 由图4可知，随着酶解温度的升高，胶原蛋白的含量也在逐渐增大，当酶解温度升高到37 ℃时，此时的胶原蛋白含量出现最高值，当再升高酶解温度时，其胶原蛋白含量呈现出缓慢下降的趋势，故最佳酶解温度为37 ℃。可能因为酶是由活细胞产生的一种特殊蛋白质，具有高效的催化作用，对底物的高效催化能力需要在一定的条件下，如最适温度、最适pH值等。

2.2.4 酶解时间对龟甲胶原蛋白提取量的影响 由图5可知，随着酶解时间的延长，胶原蛋白的含量也在逐渐增大，当酶解时间接近5 h时，胶原蛋白含量出现最佳值，当酶解时间再增大时，其胶原蛋白含量出现急速下降的趋势，故最佳酶解时间为5 h。酶解时间过短，则底物与酶的接触时间不够，使得酶解不充分；酶解时间过长，则酶有可能将龟甲中的胶原蛋白溶解。

2.3 响应面分析

2.3.1 响应面试验结果 试验中心组和设计水平如表1所示，试验结果与方案见表2，利用Design expert 10软件对试验数据进行分析，得到回归方程[8-9]：

CC(g/g)=0.12-0.010375A-0.013375B+0.003C-0.01225AB-0.0205AC-1.23759×10-19BC-0.013375A2-0.004875B2-0.012625C2

图5 酶解时间对胶原蛋白初步提取的影响

表1 Box-Behnken中心组合设计水平

表2 试验方案与结果

2.3.2 方差分析 整理数据得该拟合的二次回归模型及各项方差分析结果如表3所示，一次项中A的回归系数显著，说明酶用量对提取胶原蛋白含量的影响显著，一次项中B的回归系数极显著，说明酶解温度对提取蛋白含量的影响是极显著；交互项AB的偏回归系数显著，说明酶用量和酶解温度对提取蛋白含量有显著的影响，交互项AC的偏回归系数极显著，说明酶用量和酶解时间对提取蛋白含量有极显著的影响；2个二次项A2、C2的偏回归系数均达到显著水平[9]。回归模型是极显著的(P=0.0091<0.05),模型R2=0.5050，说明模型拟合程度一般，能够反映数据50.50%的有效性，失拟项F值为0.40(P=0.7596>0.05)，表明失拟项不显著，试验误差较小，用此模型对胃蛋白酶酶解提取龟甲胶原蛋白工艺优化的预测是可行的。遗憾的是，此模型的决定系数R2为0.5050，模型的调整确定系数R2为0.7656，它们之间相差0.2606，超过0.2。这表明此模型或数据可能有一个大的块效应问题。需要考虑的是模型还原、响应变换、异常值等，因此在以后的试验中需要有所改进。

表3 回归方程方差分析

注：*、**分别表示在0.05、0.01水平上的差异显著性。下同。

2.3.3 回归模型的优化 由于交互项中BC、二次项B2对提取蛋白含量没有显著的影响，因此采用手动优化法对回归模型再一次进行优化，优化结果为FC(15.93)>FB(14.14)>FA(9.59)，因此各因素对于龟甲中提取蛋白的影响大小顺序依次是：酶解时间(C)>酶解时间(B)>酶用量(A)。

2.3.4 响应面曲面分析 根据回归方程做出响应面考察拟合响应曲面的形状，可直观地描述各个因素之间的交互项的相互影响。等高线形状反映各个交互项之间作用的强弱，若为圆形则表示各因素的交互作用效果不显著，若为椭圆形则表示显著。如图6、图7所示的响应面和等高线可以看出各因素之间的交互作用，酶用量和酶解温度的交互作用、酶用量和酶解时间的交互作用的等高线形状均为椭圆形，因此酶用量和酶解温度的交互作用、酶用量和酶解时间的交互作用均显著。

如图6所示，随着酶用量A和酶解温度B的增大，蛋白含量先上升，达到最高点后，又逐渐下降，说明酶用量A和酶解温度B只有趋于某一中间值时，能使提取的蛋白含量达到最大值。

如图7所示，随着酶用量A和酶解时间B的增加，蛋白含量先快速上升，达到最高点后，一边明显下降，一边有上升的趋势，可能是试验操作的误差带来的结果或者最佳范围未在该区域。

图6 Y=(A.B)的等高图和响应面图

2.3.5 试验验证 对试验模型进行分析可得胃蛋白酶解龟甲提取蛋白的最佳理论工艺条件为：酶用量3.945%、酶解温度38.070 ℃、酶解时间4.754 h，此条件下的蛋白含量为0.114 g/g；考虑到实际操作的可行性，对所得工艺修正为酶用量4%，酶解温度40 ℃，酶解时间5 h，采用此工艺实际测得蛋白含量为0.111 g/g，提取率为11.08%，与理论值相对标准偏差(RSD)为0.26%，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的应用价值。

图7 Y=(A.C)的等高图和响应面图

2.3.6 考马斯亮蓝法测定胶原蛋白含量

2.3.6.1 标准曲线的试验 标准曲线的试验方案与结果见图8。

图8 牛血清蛋白标准曲线

2.3.6.2 龟甲胶原蛋白含量测定结果 如表2所示，考马斯亮蓝法测定的胶原蛋白含量总体略低于凯氏定氮法测定的蛋白含量，可能因为考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2 min左右即达到平衡，其结合物室温下1 h内基本保持稳定，但在20 min之后线性略有降低，对试验结果有一定的误差[10]；考马斯亮蓝法和凯氏定氮法测定出的蛋白含量总体呈现出一致性，表示考马斯也可用来测定此胶原蛋白的含量，而且考马斯测定蛋白质相比凯氏定氮法更加节省时间和试剂，不足之处是考马斯亮蓝法没有凯氏定氮法测定蛋白灵敏、准确；总的来说，考马斯亮蓝法和凯氏定氮法都可以用来测定该蛋白的含量。

3 结论

本试验在脱脂、单因素试验的基础上，采用响应面法优化龟甲提取胶原蛋白的工艺参数，并进行验证试验，最终确定龟甲胶原蛋白最佳提取工艺为酶用量4%，酶解温度40 ℃，酶解时间5 h，pH值1.5，提取的胶原蛋白含量为0.111 g/g。