益气化瘀解毒方对MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因在Sorafenib获得性耐药人肝癌QGY7702 细胞表达的干预研究

王亚琪 ，曾普华，郜文辉*，李 为，张 振，周 芳，俞淑娴

（1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南省中医药研究院中医肿瘤研究所，长沙 410006；3.抗肿瘤中药创制技术湖南省工程研究中心，长沙 410006；4.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410208）

在肝癌（HCC）的临床治疗中，作为一线治疗药物的Sorafenib（索拉非尼）因获得性耐药问题而临床疗效欠佳。因此，关于肝癌靶向药物Sorafenib 的耐药机制及寻找逆转耐药的新靶点或药物，是肝癌相关研究的热点和难点。目前西医治疗Sorafenib耐药尚缺乏特别行之有效的方法。中医药是当前临床治疗肝癌的基本手段之一，具有长期服用且毒副作用低、改善生存质量、抗复发和转移的优势，且中药复方配伍具有“多层次、多环节、多靶点”的整体作用，显示中医药具有防治肝癌及拮抗耐药的巨大潜力，因此从传统中医药寻求逆转Sorafenib 耐药方药可望带来新的突破[1]。中医认为瘀、毒、虚与肝癌的发生密切相关[2]，三者始终并存，互为因果，恶性循环，贯穿于肝癌整个病程。“坚者软之”，“衰者补之”，治疗当攻补兼施，故潘敏求教授[3]认为“益气化瘀解毒”是切合肝癌病机的常用治法，以此拟方“益气化瘀解毒方”。该组方药物富含人参皂甙、重楼皂苷、多糖、莪术醇、姜黄素、糖蛋白等多种抗肿瘤活性组分[4]，既往临床研究[5-6]证实具有稳定瘤体、调节免疫、改善生活质量、抗复发转移而使患者呈现“带瘤生存”的特点。前期对其研究[7-11]提示该方可抗肝癌血管新生、抑制血管拟态形成及EMT 转变，调节肿瘤微环境等抗肿瘤作用。因此，本研究试以探讨MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因表达水平与Sorafenib 获得性耐药人肝癌QGY7702 细胞的耐药性的相关性，以临床效验方“益气化瘀解毒方”进行干预[6]，旨在明确其对获得性耐药细胞及相关基因表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌QGY7702 细胞和人肝癌QGY7702/Sorafenib 细胞均由上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所刘祖龙博士惠赠。高糖DMEM 培养基（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco）；CCK-8 试剂（东仁化学科技上海有限公司）；DMSO（BioFroxx）；TRIzol ® Reagent（Life Technologies）。Sorafenib（南通飞宇生物科技有限公司，批号：FY34720409，规格：200 mg/瓶）。益气化瘀解毒方（白参10 g，黄芪30 g，醋莪术15 g，重楼15 g，半枝莲30 g，甘草5 g 等）饮片购自湖南中医药大学第一附属医院。QuantiFast®SYBR®Green PCR Kit试剂盒（Qiagen，货号：204054），荧光定量PCR 仪（Roche，货号：LC480 Ⅱ）

1.2 方法

1.2.1 肝癌细胞的培养 将人肝癌细胞株QGY7702或耐药株QGY7702/Sora 接种于10% 胎牛血清加90%DMEM 加1%青霉素/链霉素双抗溶液的完全培养基中，置于37 ℃，5% CO2的培养箱内。当细胞铺满85%左右时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

1.2.2 药物的配制 1）Sorafenib 储存液的配制：用20 mL DMSO 溶解200 mg Sorafenib 配制成20 mmol/L浓度储存液，-20 ℃保存。使用前稀释至所需工作浓度。2）中药的煎煮：按比例配置好药材，加入适量冷水浸泡30 min，文火煎煮，第一道10 倍水煎煮2 h，第二道8 倍水煎煮1 h，两道混合过滤、离心去渣，再将药物浓缩至含1 g 生药/mL，高压灭菌后置于4 ℃备用或-20 ℃保存。

1.2.3 CCK-8 法检测药物IC50 值及对细胞增殖影响 取对数生长期的肝癌细胞用0.25 %胰蛋白酶消化，1 000 r/min，4 ℃，5 min 离心，去上清，用常规培养基配成细胞混悬液，浓度约为（6～8）×104/mL，种入96 孔板，每孔100 μL，96 孔板周边孔以PBS 填充，置于37 ℃，5% CO2的培养箱内培育。在培养箱内培养24 h 后，用PBS 清洗后，向孔板中加入不同浓度的药物（Sorafenib 浓度梯度为80、40、20、10、5、2.5 μmol/L；益气化瘀解毒方浓度梯度为500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL），每组设置5 个平行孔，继续培育24、48、72 h（48 h用PBS清洗后换液）。用PBS 清洗后，每孔加10 μL CCK-8 溶液+100 μL 完全培养基，继续置于培养箱中孵育1～4 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度（OD），并计算药物对细胞的抑制率，抑制率=[（对照孔OD-实验孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）]×100%。根据IC50 值计算耐药指数（RI），RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

1.2.4 RT-PCR 检测MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因表达水平 将处于对数生长期的耐药细胞以7×105个/孔的浓度接种于6 孔板，第6 孔接种亲本细胞，24 h 后分别给予Sorafenib 组（8 μmol/L）、益气化瘀解毒方组（70 mg/mL）、中西联合组（Sorafenib 联合益气化瘀解毒方各半），其余耐药细胞做模型组，亲本细胞做空白对照组，给予完全培养基处理，干预48 h 后，PBS 充分洗涤后，参照Trizol 试剂盒说明书提取细胞总RNA，用荧光定量PCR 检测各组细胞中MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因的表达量。扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火及延申30 s，40个循环。利用QuantiFast®SYBR®Green PCR Kit 试剂盒(Qiagen，Germany)在LightCycler®480 Ⅱ型荧光定量PCR 仪(Roche，Swiss)上进行反应，并重复3 次。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计分析软件处理，数据用均数±标准差（）表示，计量资料采用多样本单因素方差分析及多重分析。

2 结果

2.1 CCK8 法检测QGY7702/Sora 细胞的耐药性 CCK8检测结果显示，QGY7702/Sora 细胞的Sorafenib IC50值和RI 均明显高于QGY7702 细胞，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。RI 约为2.5，属于低度耐药。

表1 QGY7702 和QGY7702/Sora 细胞的Sorafenib IC50 值及RI（）

表1 QGY7702 和QGY7702/Sora 细胞的Sorafenib IC50 值及RI（）

注：2 组比较，## P ＜0.01

2.2 益气化瘀解毒方对耐药细胞增殖影响 通过CCK-8 法检测益气化瘀解毒方对耐药细胞24、48和72 h 后增殖活性，由图1 增殖曲线可见，益气化瘀解毒方可抑制QGY7702/Sora 细胞的增殖活性，且耐药细胞的存活率随浓度与时间增加而不断下降，并具一定的剂量和时间依赖性。中药 IC50 值为（71.08±4.47） mg/mL。

图1 益气化瘀解毒方对耐药细胞增殖影响

2.3 荧光定量PCR 检测MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因的表达水平 通过荧光定量PCR 对MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因表达量的检测，发现亲本细胞与耐药细胞对三基因表达水平并无显著异。Sorafenib 组可明显提高MRP、GST-π 的 表达量（P＜0.01、P＜0.05）；益气化瘀解毒方组可显著降低GST-π 的表达（P＜0.01）；益气化瘀解毒方联合Sorafenib 组可显著促进Topo Ⅱ表达（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

肝癌是我国男性高发的恶性肿瘤，但目前临床肝癌在诊疗过程存在许多问题导致其预后差，如早期诊断困难、复发转移率高、治疗缺乏针对性、源头创新药物少、药物耐药等问题，其中药物耐药性问题是导致临床肝癌预后差的重要原因之一。有研究[12]提示，部分三期临床实验中仅有2%～3%的肝癌患者对Sorafenib 治疗有疗效，大部分患者即表现Sorafenib原发性耐药，而且Sorafenib 延长晚期肝癌患者的生存期也仅有2～3 个月，之后即表现获得性耐药。目前，Sorafenib 原发性或获得性耐药已成为影响患者总体生存期的重要因素。因此，深入探讨Sorafenib 耐药对于改善肝癌治疗及预后具有重要意义。

表2 各组细胞MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因的表达水平

目前多数研究表明，在体外通过低浓度持续诱导法或大剂量间歇诱导法可建立耐药细胞株[13-15]。本实验采用大剂量冲击法结合低浓度持续干预法诱导建立QGY7702/Sora 耐药细胞株[16]，通过CCK8 法检测细胞的耐药性，实验证实QGY7702/Sora 细胞的Sorafenib IC50 值 为（19.651±1.216）μmol/L，RI 为（2.470±0.276），说明该细胞株具有耐药性，呈低度耐药。

据文献研究提示，目前耐药被分为典型抗药机制和非典型抗药机制[17]。其中，多耐药相关蛋白（MRP）在典型抗药机制中发挥重要作用，谷胱甘肽S-转移酶（GST）和DNA 拓扑异构酶（Topo）在非典型抗药机制中发挥重要作用。MRP 是由COLE 等[18]在1992 年对耐阿霉素小细胞肺癌细胞株H19/AR 的研究中发现，是分子量为190KD 的ATP 依赖泵型跨膜转运蛋白，主要位于细胞膜。其机制可能是随着药物的使用引起MRP 的过表达或者肿瘤自身对MRP 基因的过表达，通过药泵的作用将药物逆浓度差泵出胞外，降低胞内药物浓度，从而导致耐药的产生[19-20]。这种药物外排机制被称为经典的MDR 机制，MRP 表达水平与耐药程度呈正比。此外有研究提示[21]，MRP 基因在食道癌的表达量明显高于其他肿瘤组织，这可能与食道癌化疗的原发性不敏感性有关。GST[22]是一类与机体解毒作用有关的酶类，其中GST-π 是GST 家族中与恶性肿瘤关系最密切的一种Ⅱ期解毒酶，主要存在于参与机体解毒、排毒的人体正常组织细胞的胞质中，如呼吸消化系统和泌尿系统等。主要以催化方式降解药物促进其代谢，降低抗肿瘤药物的细胞毒作用而产生耐药，其表达高低与肿瘤耐药性成正比[23]。TopoⅡ[24-25]是机体内重要的核酸酶，参与DNA 的转录、翻译、复制及染色体分离等遗传过程，主要存在于S-G2/M 期。主要在核内发挥生理作用，影响DNA的结构和拓扑学，并与期间核基质、有丝分裂染色体配对、染色体分离、基因重组和转录及DNA 损伤与修复有密切关系。Topo Ⅱ含量和或活性的降低与肿瘤细胞产生耐药密切相关，与肿瘤耐药成反比。

本实验研究结果提示，耐药细胞MRP、GST-π和Topo Ⅱ基因的表达水平与亲本细胞无显著差异，但两者对于Sorafenib 的敏感性有显著差异，说明肝癌细胞可能存在多种其他耐药基因的异常表达或原发性不敏感性现象，需进一步实验证实。Sorafenib可促进耐药细胞对MRP、GST-π 表达，提示肝癌细胞对Sorafenib 敏感性降低与MRP、GST-π 基因的过表达密切相关。MRP 是多耐药相关蛋白，与多种化疗药物耐药相关。而目前研究提示临床患者多数存在Sorafenib 原发性耐药，这可能与肝癌患者靶向治疗前其他治疗相关。故Sorafenib 获得性耐药应与GST-π 基因的过表达密切相关。而益气化瘀解毒方既可抑制耐药细胞增殖活性，亦可抑制GST-π 基因的过表达，故益气化瘀解毒方可拮抗Sorafenib 获得性耐药。

综上所述，肝癌Sorafenib 获得性耐药与GST-π基因的过表达相关，而益气化瘀解毒方可通过抑制GST-π 基因的过表达来拮抗Sorafenib 获得性耐药。同时，亲本细胞与耐药细胞的差异不仅仅局限于比较MRP、GST-π 和Topo Ⅱ，应进一步检测其他蛋白或基因等表达的差异，精准治疗，指导临床，针对性选择敏感性药物，个性化合理用药，对改善肝癌预后具有重要的意义，值得进一步研究探讨。