人参总皂苷对皮肤细胞的修复作用机制研究

鹿 禛，邱智东，王 蕾，陈江丽，金 叶

（长春中医药大学药学院，长春 130117）

衰老是自然界最基本的规律之一[1]，皮肤衰老是指皮肤在外源或内源性的因素影响下皮肤出现的外部形态、结构以及功能衰退的过程。内源性因素指的是皮肤细胞的自然衰老；而皮肤因外界环境因素或生活方式的原因而出现的皮肤松弛、干燥及皱纹、色斑等现象则被称为皮肤老化的外源性因素，其中最主要的因素就是紫外线照射，所以外源性老化也被称为皮肤的光老化[2]。人参为五加科人参属多年生草本植物人参的干燥根[3]，现代医学研究表明，人参具有调节中枢神经系统、抗衰老等作用[4-7]。

根据以上，本研究通过建立人皮肤成纤维细胞（CCC-HSF-1）衰老模型，利用蛋白质印迹法 （Western Blot）检测凋亡相关蛋白探究人参总皂苷对人皮肤成纤维细胞（CCC-HSF-1）凋亡的影响，观察人参总皂苷能否通过影响细胞凋亡来发挥其抗衰老功效，并通过建立大鼠光老化模型，观察人参总皂苷对紫外线引起的大鼠皮肤光老化的修复效果[8]。

1 实验材料

人参总皂苷（上海源叶生物有限公司）；阿霉素（DOX）（吉林大学实验室配置）；DMEM 高糖培养基（美国gibco）、PBS、胰酶（实验室配制）、青霉素链霉素双抗（Hyclone）、胎牛血清（gibco）；Cell counting kit-8 试剂盒（博士德生物）、台盼兰（Solarbio）、BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物）、Hoschst 33342 染色液（Solarbio）、FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD PharmingenTM） ；Gapdh、BaX、Bcl-2、Cleaved-caspase3、抗体Goat anti-Mouse ISG HRP、Goat anti-RabbitISG HRP。酶标仪（MOLECULAR DEVICES）；电泳仪（WEALTEC）；自动细计数仪（Invitogen CountessTM）；培养箱（Thermo Scientofic 371）、生物安全（Thermo 1300 Series A2）柜；水浴锅（Thermo Fisher Scientific Precision GP 05）；离心机（Thermo Scientific HERACUS MEGAFUGE ）；显微镜（Invitrogen By Thermo Fisher Scientific,EVOS XIL Core）；流式细胞仪（Beckman Gytoflex）；智能成像系统（i Bright FL1500）；全自动细胞成像系统（EVOS FL Auto）；紫外辐照箱（自制）；紫外线灯管（UVA：340-40W，波长范围320～400 nm；UVB 313-40W，波长范围300～320 nm）荷兰Philips 公司；UV-A 型紫外辐照计（北京师范大学光电仪器厂）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将人皮肤成纤维细胞（CCC-HSF-1）接种于DMEM 高糖培养基（含15%胎牛血清、1%链霉素-青霉素）中，置于37 ℃，5%的CO2培养箱中培养，3～4 d 以1:3 的方式传代1 次，取第3 或第4代细胞进行实验。

2.2 CCK-8 法检测不同浓度DOX 处理CCC-HSF-1 细胞的存活率 取处于对数生长期的人皮肤成纤维细胞用胰酶消化，以每孔200 μL 细胞悬液即每孔5×103个细胞接种于96 孔板中，之后将培养板移入培养箱中，在37 ℃，5%的CO2条件下培养，待细胞贴壁生长良好且细胞密度达到30%～40%时吸除细胞培养液，分别加入不同浓度的DOX（0，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L）处理12 h，按照CCK-8 试剂盒说明书处理后，用酶标仪检测细胞的吸光值（OD），波长调整为450 nm。细胞存活率的计算公式为：细胞存活率＝（样品组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）×100%。

2.3 CCK-8 法检测不同浓度DOX 和人参糖肽处理CCC-HSF-1 细胞的存活率 将处于对数生长期的人皮肤成纤维细胞接种于96 孔板中，37 ℃孵育，待细胞生长至融合状态时，弃去原培养基，加不同浓度DOX（0，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L）处理12 h 后，再加入浓度为1.00 mg/mL 人参总皂苷处理48 h，最后按2 中的方法计算各组细胞存活率。

2.4 Hoschst 33342 染色检测CCC-HSF-1 细胞凋亡 取生长状态良好的人皮肤成纤维CCC-HSF-1 细胞，分为空白组（不加DOX 和人参总皂苷），模型组（只加DOX 0.5 μmol/L）和给药组（0.30 mg/mL 和1.00 mg/mL的人参总皂苷）将其以8×104/mL 接种于6 孔板中，在37 ℃，5% CO2的条件下培养过夜后，弃去培养基，在模型组和给药组分别加入DOX 处理12 h 后，再在给药组中加入不同浓度的人参总皂苷（0.30 mg/mL 和1.00 mg/mL）继续培养48 h，之后加入1 mL Hoechst 33342 工作液，37 ℃避光孵育30 min，弃染色液，用PBS 洗涤3 次，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

2.5 Annexin V/PI 双染色检测CCC-HSF-1 细胞凋亡 取生长状态良好的人皮肤成纤维CCC-HSF-1 细胞接种于6 孔板中，按上2.3 的方法处理48 h 后，弃上清，用不含EDTA 胰酶消化，1 400 r/min，离心5 min，收集细胞单悬液，再用PBS 洗3 遍后，加入200 μL Binding buffer、5 μL 的Annexin V FITC 染液和5 μL PI染色液，混匀，避光，室温孵育15 min，用流式细胞仪进行检测。

2.6 蛋白质印迹法 （Western Blot）检测凋亡相关蛋白 同上方式对细胞进行分组处理，48 h 后收集细胞样品，PBS 洗3 遍后，加入RAPI 裂解液裂解4 h 以上，120 000 r/min，离心30 min，收集上清，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，制备120 μL 的蛋白样品。蛋白样品用SDS 聚丙烯凝胶分离后转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭1.5 h，加入一抗（Gapdh、BaX、Bcl-2、Cleaved-caspase3），4 ℃孵育过夜，第二天PBST洗涤3次，加入经辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育1.5 h 后，洗膜，显色。

2.7 大鼠紫外线急性损伤模型的建立

2.7.1 分组 32 只SD 大鼠，随机分为4 组：正常对照组、模型对照组、阳性（维生素E）对照组以及人参总皂苷组。

2.7.2 动物剃毛 分组后单笼饲养在专用鼠笼中，环境设施符合实验动物清洁级别，温度为20～25 ℃，湿度为40%～70%，光照符合昼夜交替。适应性饲养1 周后开始辐照。辐照前，参照文献[9-10]对大鼠背部皮肤进行剃毛处理，面积大约为3 cm×3 cm。

2.7.3 照射 照射前对UVA 及UVB 辐射强度进行测量，37.34 J/cm2为最小红斑量（minimum erythema quantity）。将剃毛后的大鼠放入自制的紫外线灯箱中，固定照射距离为10 cm，进行紫外线（UVA 加UVB）照射。直至造模结束，即大鼠背部皮肤出现干燥，起皮，甚至局部有溃烂现象。

2.7.4 给药 除正常对照组及模型对照组外，阳性对照组和人参总皂苷组分别于实验动物背部涂抹等浓度的维生素E 及人参总皂苷溶液，连续给药1 周后观察各组大鼠皮肤状态。

3 实验结果

3.1 不同浓度DOX 处理CCC-HSF-1 细胞的存活率 CCK-8 结果显示（图1），经DOX 处理后，与空白组相比，随着DOX 的浓度的增加，细胞存活率明显下降（P＜0.01），并呈现量效关系。

图1 不同浓度DOX 处理CCC-HSF-1 细胞的存活率

3.2 不同浓度DOX 和人参总皂苷共同处理CCCHSF-1 细胞的存活率 由图2 中可以看出，加入人参总皂苷后，与图1 相比，细胞存活率明显提高（P＜0.01)，说明人参总皂苷对DOX 损伤的CCC-HSF-1 细胞有一定的修复作用。

图2 不同浓度DOX 和人参总皂苷共同处理CCC-HSF-1细胞的存活率

3.3 人参总皂苷对人皮肤成纤维细胞凋亡有明显的抗凋亡活性 利用DOX建立CCC-HSF-1细胞凋亡模型。经Hoechst 33342 染色后，在荧光显微镜下观察到，空白组细胞形态规则，胞核完整，染色均匀，经DOX处理12 h 后的模型组，细胞形态及细胞核发生改变，而加入人参总皂苷后的给药组，镜下可见凋亡细胞的数量明显的减少（图3）。

图3 Hoechst 33342 染色的细胞凋亡结果

利用流式细胞仪对CCC-HSF-1 细胞凋亡模型进行Annexin V/PI 双染，结果如图4（A-D）所示，与空白对照组相比，模型组具有明显的细胞凋亡现象（18.36%）；而加入人参总皂苷修复后CCC-HSF-1 细胞的凋亡率（15.53%，9.09%）与模型组（0.5 μmol/L DOX）相比有明显的下降（P＜0.05）。证明人参总皂苷对皮肤成纤维细胞具有明显的抗凋亡活性。

图4 流式细胞术检测人参总皂苷和DOX 处理后各组CCC-HSF-1 细胞的凋亡率

3.4 人参总皂苷对凋亡相关蛋白的作用研究 利用人参糖肽处理DOX 诱导凋亡的CCC-HSF-1 细胞，并通过Western Blot 检测凋亡相关蛋白。结果显示，与模型组相比，各给药组BaX、Cleaved-caspase3 蛋白水平明显降低，Bcl-2 蛋白水平上升，证明人参总皂苷能抑制DOX 损伤所带来的凋亡，对CCC-HSF-1 细胞有一定的修复作用。

图5 人参总皂苷对CCC-HSF-1 细胞凋亡相关蛋白的调控作用

3.5 人参总皂苷对紫外线照射致大鼠皮肤光老化的修复作用研究 为了检测人参总皂苷对紫外线所致皮肤损伤的保护作用，我们建立了紫外线损伤大鼠模型。结果如图6 所示，空白对照组大鼠剃毛，不接受紫外线照射，皮肤光滑细腻，纹理清晰，没有明显的红斑和皱纹，皮肤状态健康；模型对照组剃毛后只接受紫外线照射而不给予药物治疗，皮肤颜色变红，皮肤发紧，起皮，有波纹状皱纹出现，局部有溃烂现象；阳性对照组（维生素E）大鼠剃毛照射后给予阳性药物（维生素E）治疗1周后皮肤有少量起皮现象，有少许褶皱，略微发红；人参总皂苷组大鼠剃毛照射后给予人参总皂苷治疗1 周后皮肤有较少的起皮现象，接近正常对照组。通过对4 组大鼠皮肤状态的观察说明人参总皂苷能够有效修复紫外线照射导致的皮肤损伤。

图6 人参总皂苷对紫外线照射致大鼠皮肤急性损伤的修复作用

4 结论

衰老是生物体随着年龄的增长，机体内组织、器官等功能退化的过程。而衰老的结果是体内和体外共同作用的结果。皮肤同机体其他器官一样，在内源性和外源性因素的共同作用下，将不可避免的产生老化。许多中药含有多种氨基酸、多糖、有机酸、生物碱、皂苷成分，他们具有清除自由基，增强抗氧化的能力，能提高皮肤胶原纤维及胶原蛋白含量，调节机体免疫功能，改善皮肤微循环等[11]。本研究利用DOX 建立人皮肤成纤维细胞凋亡模型，通过一系列生化实验，研究了人参总皂苷对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响：人参总皂苷通过上调Bcl-2 蛋白水平，降低BaX、Cleaved-caspase3 蛋白水平来抑制由DOX 引起的细胞凋亡；通过建立大鼠紫外光老化模型，对实验各组大鼠皮肤状态的观察，可以看到人参总皂苷对紫外线造成的大鼠皮肤损伤具有较好的修复作用。