试纸法测定蛋白质的研究

高俊杰，陈 达

(沈阳理工大学 环境与化学工程学院,沈阳 110159)

测定蛋白质含量的方法有很多，从原始的一百多年前的浊度法、凯氏定氮法中走出来，改变原体系的光谱性能，从而达到定量测定的目的。目前研究较多、应用较广、操作较为简便的是吸光光度法[1-3]、荧光光度法[4]，以及新发展起来的共振瑞利散射法[5]、高效液相色谱法[6]等等。这些方法都需要专业人员用专业仪器进行测定。

试纸法[7]是纸层析法中的一种，纸层析法用滤纸作为载体，用一定溶剂(展开剂)展开而达到分离的目的。根据其分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。

试纸法具有携带方便、使用方便、快速，适用于现场检测，没接受过专业培训的人员也可以使用，拓宽了应用范围。

现在常用的试纸法是在滤纸上以一定的方法负载上相应的试剂，使其对某种物质具有反应性能，能指示出该物质的存在和含量。目前市售的测定试纸都是通过颜色变化，利用色标指示试样含量的。

本文测定蛋白质试纸是利用刚果红与蛋白质在一定条件下生成红色复合物为基础，制作试纸，根据试纸变色的长度，由工作曲线或长度标尺确定蛋白质含量。这种方法使测定结果的精密度和准确度比观看颜色更精确。此法目前报道的不多，是一种行之有效有发展前景的测定方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

0.1mol/L盐酸；0.1mol/L柠檬酸钠；5.0×10-5mol/L刚果红；0.1%(十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)；5mg/mL淀粉溶液；5mg/mL抗坏血酸溶液；1g/L牛血清蛋白；紫外可见分光光度计，分析天平；酸度计。

1.2 实验方法

1.2.1 试纸制作方法

取中性层析滤纸，剪裁成10mm宽一定长度的试纸条，并在试纸下端5mm做一下标记。

在10mL比色管中加入4mL刚果红，然后加入一定酸度的缓冲溶液，加入0.1mL CTMAB再加入2mL淀粉溶液，0.8mL抗坏血酸溶液，定容摇匀，再将试纸条完全浸入其中，浸泡15min左右取出晾干。

1.2.2 测定方法

取10mL的待测溶液到小烧杯中,3个制作好的试纸条浸入溶液5mm，反应15min后，立即从标记处测量试纸上色带的高度(长度)，取平均值，在试纸标尺或工作曲线上查出蛋白质含量。

2 结果与分析

2.1 实验条件的选择

2.1.1 缓冲体系及酸度的确定

酸度值是影响蛋白质与显色剂结合反应的重要因素。在柠檬酸钠-盐酸缓冲体系中，刚果红与BSA的结合反应在室温下能很快进行，且反应快速，颜色对比性好，灵敏度高。试验结果如表1所示，在pH值为2.0～3.0时，选取不同酸度，得出pH为2.62时反应效果最好，试纸颜色变化最为明显。

表1 缓冲溶液pH的确定

2.1.2 溶液中各组分含量的确定

缓冲溶液含量在1～2mL时随着缓冲溶液用量的增加，试纸颜色变化越明显，表2为缓冲溶液用量，从表2中可以看出，缓冲溶液的用量为1.2mL和1.4mL时试纸变色长度最长，为节约试剂用量，取缓冲溶液的用量为1.2mL。

表2 缓冲溶液用量的确定

2.1.3 反应温度的选择

在20～25℃的室温条件下，试纸染成蓝色的过程较慢，耗费时间长；试纸晾干过程受温度影响很大，温度稍高或受到光照试纸即会变色，稳定性差；所以需要在阴凉干燥处晾干试纸。

2.1.4 表面活性剂的选择

表3为表面活性剂用量。由于表面活性剂有增溶、增稳、增敏、增效、催化、分散、富集、乳化、提高抗干扰性和提高选择性等作用，为了缩短制作试纸的时间，改善试纸的分析性能，通过比较CTMAB和吐温-80，在表3中可知CTMAB为0.1mL和0.15mL时实验结果最好，为节约成本，选定CTMAB的最佳用量为0.1mL。

表3 表面活性剂用量

2.1.5 淀粉用量的选择

淀粉作为稳定剂使用，取0.5g淀粉将其溶解在100mL热水中作为原溶液，取1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL淀粉原溶液，向其中加入4.0mLGCR，1.2mL缓冲溶液，0.1mLCTMAB。结果表明，随淀粉加入量的增多，滤纸变蓝效果越明显，吸附效果越好，染色速度加快。用2.0mL淀粉制备的溶液浸泡后的试纸晾干后，浸入蛋白质溶液中，试纸变红速度明显加快，反应时间缩短。

2.1.6 抗坏血酸的确定

抗坏血酸最为抗氧化剂，加入含量的多少影响着试纸在制备后颜色变化的程度和反应效果，取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL抗坏血酸，向其中加入4.0mLGCR、1.2mL缓冲溶液、0.1mLCTMAB。结果表明，加入抗坏血酸量过少，制得的试纸在晾干过程仍容易被氧化而变成红色；但加入抗坏血酸的量过多，虽然能使试纸在晾干过程中保持蓝色不变，但将试纸浸入蛋白质溶液中后，反应速度很慢，试纸变红所需时间太长且试纸变红的长度太短，效果不好；而加入0.8mL抗坏血酸制得的试纸不仅在晾干过程中保持蓝色，且其与蛋白质反应速度较快，效果很好。

2.2 工作曲线和试纸标尺的制作

按试验方法测定不同浓度的蛋白质标准样品，制作标准曲线如图1所示。

由图1可以看出，在40～120mg/L之间，试纸的变色长度与蛋白质浓度之间存在线性关系，其线性方程为y=0.2975x+3.3(40mg/L≤y≤120mg/L)。相关系数r=0.9172

应用本方法也可较直观地制作一个刻度标尺，测定变色长度，通过直接比较得到结果，根据标准样品测定结果值，得试纸标尺如图2所示。

图1 蛋白质标准曲线

图2 试纸标尺

2.3 样品的测定

用制得的试纸测样品：奶粉(浓度100mg/L)、尿液和污泥，样品分别取10mL，每种样品分别测量5次。

2.4 污泥的预处理

取60.0mL的污泥，以5000r/min离心10min,取上清液加入0.9%NaCl使之达到60.0mL，在5000r/min的条件下离心10min,重复清洗3次，保留第三次污泥溶液。加数滴1mol/L的NaOH溶液，使pH为11，在80r/min的磁力搅拌器下搅拌10min，在80℃下水浴30min，冷却至室温，再在5000r/min下离心20min，用0.45μm滤膜过滤待用。测奶粉时，试纸平均变色长度为34.1mm；测尿样时，试纸平均变色长度为21.3mm。配制浓度为100mg/L的奶粉，取10mL与100mL放入小烧杯，用所制的蛋白质试纸平行测定5次，记录下纸带变色的长度，计算出测定值和精密度；然后分别取5mL的奶粉、尿液和活性污泥分别放入100mL的小烧杯中，再加入浓度为40mg/L的牛血清蛋白标准溶液，摇匀，用所制的蛋白质试纸平行测定5次，记录下纸带变色的长度，以此确定加标回收率。结果如表4所示。由表4可知，试纸法对奶粉的测定效果最好。

表4 试纸法测定结果

2.5 对照实验

考马斯亮蓝(CBB)[8]法是一种经典的测量蛋白质的方法，本文对样品用CBB进行实验，样品测定结果见表5。

表5 考马斯亮蓝法测定结果

由表5和表4对比可以看出，试纸法与考马斯亮蓝法测定结果相符，表明试纸法的测定结果可信。

3 结论

本实验的试纸法是通过标尺上颜色的变化长度来进行定量分析测定蛋白质的，比常见的试纸法更容易操作，测定结果更准确、精密，方法操作简单、快速，可以对40～120mg/L蛋白质进行定量测定，与测定蛋白质的经典方法(考马斯亮蓝法)相比较无显著差异。此方法适用于含蛋白质的奶粉、尿液、污泥等样品中蛋白质的测定。