肝泡型包虫病肝组织和血清中巨噬细胞极化特点及临床意义

鄂维建 芦永良 张灵强 宇文昊 王志鑫

青海大学附属医院1检验科，2肝胆胰外科（西宁810001）

多房棘球蚴病（alveolar echinocococosis，AE）又称泡型包虫病，属于感染棘球绦虫的幼虫所致的一类人兽共患寄生虫病，以肝脏感染为最常见，具有恶性化程度高、预后较差等特点[1]。全球约有超过90%的肝泡型包虫病集中在我国经济和医疗水平相对落后的西部地区[2]。2016-2017年，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所联合青海省地方病预防控制所等多家机构对青海、四川、新疆和甘肃等4个省份（自治区）进行了抽样调研，AE在青海省的发病率为0.63%，人均伤残损失寿命为2.434年，疾病负担为32.24 万人年[3]。沉重的疾病负担严重严重影响了我省居民的生活质量，因而加强我省AE的防治工作刻不容缓。多房棘球蚴作为外源性病原体，可长期寄生在宿主体内，易引发机体复杂的免疫反应[4]。巨噬细胞在其中发挥着重要作用[5]。在不同环境的刺激下巨噬细胞可极化为经典活化巨噬细胞（M1型巨噬细胞）和替代性活化巨噬细胞（M2型巨噬细胞），前者通过释放白细胞介素（IL-6）、IL-12、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等放大炎症反应，而后者则在组织修复时分泌转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、IL-10 等抑制炎症反应[6-7]。既往有研究证实，巨噬细胞极化与寄生虫感染密切相关[8]。但是肝多房棘球蚴病患者病灶周围就伴有炎症反应，因此巨噬细胞极化是否在肝多房棘球蚴病中也发挥重要作用尚不明确。本研究旨在了解肝泡型包虫病灶旁组织中Ml、M2 巨噬细胞分型及相关细胞因子的表达量变化，为阐明AE的发病及转移机制以及临床防治工作的开展提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 标本来源收集2017年1月至2019年2月30例肝泡型包虫病患者的肝组织标本以及相应的血液标本，所有组织标本均来自于青海大学附属医院手术室，包括男12例（40.0%），女18例（60.0%），年龄为18～72岁，平均（43.10±13.01）岁。纳入标准：（1）根据病史、临床表现、实验室和影像学检查证实，并经外科手术冰冻切片病理检查确诊为肝泡型包虫病者；（2）术前未接受放化疗等相关治疗者。排除标准：（1）并发急慢性感染（包括病毒性感染以及败血症、严重上呼吸道感染、肺部或胆道感染、高热等感染性疾病）、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、风湿性疾病患者；（2）合并有严重的梗阻性黄疸者；（3）应用炎症抑制药如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等患者；（4）合并囊性包虫病及其他寄生虫患者。

根据病灶分布部位将肝脏标本分为病灶邻近（距病灶≤2 cm）组织（para-lesion，PL）和正常肝脏（距病灶＞2 cm）组织（normal，N）。对患者肝功能进行Child-pugh 肝功能分级[9]。本研究参照Helsinki Declaration，获得青海大学附属医院医学伦理委员会的批准。所有参与实验患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血液标本和组织标本采集（1）患者确诊后采集外肘静脉血4 mL，室温静置，收集上清；另外从我院健康体检中心收集30例健康人群（年龄、性别与肝泡型包虫病患者相匹配）的血清样本。（2）患者术中收集肝脏组织，迅速置于4%多聚甲醛中固定48 h，制作石蜡块，并进行组织切片。

1.2.2 病理切片HE染色取病理组织切片，脱蜡、二甲苯-乙醇透明后，滴加苏木素染液，1%盐酸酒精分化，滴加伊红染液，脱水、透明、封片，观察PL组织与N组织在形态结构方面的差异。

1.2.3 检测血清细胞因子采用ELISA 法检测患者和健康人群血清中IL-6、IL-10、TNF-ɑ和TGF-β1水平，按照试剂盒操作进行，ELISA 试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2.4 免疫组化法检测组织CD86、CD11c和CD206表达及结果判定采用常规envision 二步法检测。取病理切片烤片、脱蜡至水，滴加柠檬酸钠缓冲液，加热进行组织抗原修复；山羊血清封闭。滴加足量的CD86（1∶100 稀释，美国CST公司）或CD11c（1∶100 稀释，美国CST公司）或CD206抗体（1∶200 稀释，美国CST公司），置于湿盒中4℃孵育过夜；滴加即用型二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB 显色（北京中杉金桥生物技术有限公司）；苏木素浸染细胞核，脱水，透明，中性树胶封片。结果判定：CD86、CD11c 或CD206 均以细胞膜出现黄色或棕黄色染色为阳性细胞。低倍镜寻找阳性染色较多的5个视野，更换为高倍镜，根据阳性细胞百分比（≤10%，计0分；11%～30%，计1分；31%～70%，计2分；＞70%，计3分）和染色强度（无=0分，淡黄=1分，棕黄=2分，棕褐=3分）计分。两项分数之和若≤2分，则为阴性表达，＞2分为阳性表达。

1.3 统计学方法分别利用IBM SPSS 17.0软件和GraphPad prism 软件进行数据分析和作图，非正态分布以中位数（四分位间距）表示，进行非参数检验；正态分布数据以均值±标准差表示，进行独立样本t检验。采用Pearson 相关性分析M2/M1比值与肝功能指标的关系。肝组织中CD86、CD11c、CD206 阳性表达率以构成比（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝泡型包虫病肝组织形态学观察经肉眼观察，肝泡型包虫病病灶为不规则形、海绵状、淡黄色或白色团块，与正常肝组织界限不清，囊泡内为豆腐渣样小泡。经HE染色和显微镜观察，肝组织内存在大小不一的囊泡，病灶中央为凝固状坏死区域，且有大量炎症细胞浸润，部分病灶呈纤维化或钙化。见图1。

图1 肝组织形态学观察（HE染色×40）Fig.1 HistoMorphology of hepatic tissue by HE staining（×40）

2.2 肝泡型包虫病肝组织中CD86、CD11c和CD206的表达差异经免疫组化法检测，30例肝泡型包虫病PL肝组织中巨噬细胞CD86+和CD206+M2型巨噬细胞阳性表达率和阳性细胞百分比/视野明显高于N肝组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。但是PL肝组织和N肝组织中CD11c+M1型巨噬细胞阳性表达率和阳性细胞百分比/视野比较无显著统计学差异（P＞0.05）。另外，肝泡型包虫病PL肝组织中M2/M1型巨噬细胞比值（3.98±0.76）明显高于N肝组织（1.09±0.12），差异有统计学意义（t=20.573，P＜0.001）。见表1和图2。

图2 免疫组化法检测CD86、CD11c和CD206在肝泡型包虫病肝组织中的表达情况（×400）Fig.2 Expression of CD86，CD11c，CD206 macrophages in AE para-lesion tissue and normal liver tissue（×400）

表1 肝泡型包虫病肝组织中CD86、CD11c和CD206 阳性表达情况Tab.1 Positive expression of CD86，CD11c，CD206 macrophages in AE para-lesion tissue and normal liver tissue例（%）

2.3 肝泡型包虫病患者和健康对照人群血清细胞因子水平比较肝泡型包虫病患者包虫抗体阳性率以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平明显高于健康人群，而白蛋白低于健康人群，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.4 肝泡型包虫病患者PL肝组织M2/M1型巨噬细胞比值与肝功能的关系根据Child-pugh 肝功能分级，肝泡型包虫病患者包括A级11例，B级14例，C级5例。A级、B级、C级患者PL肝组织中M2/M1比值分别为（3.75±0.48）、（4.10±0.57）、（4.56±0.30），经方差分析，差异有统计学意义（F=9.103，P= 0.001）。另外，肝泡型包虫病患者PL肝组织中M2/M1型比例与谷丙转氨酶呈正相关，而与白蛋白水平呈负相关（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

AE是棘球蚴病的特殊类型，AE的生物学特性与恶性肿瘤类似，具有外生、浸润性生长的特点[10]。随着精准肝胆外科理念的提出以及加速康复外科的实施，患者的预后逐渐改善，但是据2012-2016年最新流行病学统计，我国肝泡型包虫病10年病死率超过90%[11]。因此，揭示肝多房棘球蚴病的致病机制和转移机制迫在眉睫。

表2 肝泡型包虫病患者和健康对照人群一般资料和血清细胞因子水平比较Tab.2 Clinical data and serum cytokines in AE patients and healthy volunteers ±s

表2 肝泡型包虫病患者和健康对照人群一般资料和血清细胞因子水平比较Tab.2 Clinical data and serum cytokines in AE patients and healthy volunteers ±s

变量性别[例（%）]男 女年龄（岁）包虫抗体[例（%）]阳性阴性职业背景[例（%）]牧民非牧民谷丙转氨酶（U/L）谷草转氨酶（U/L）白蛋白（U/L）碱性磷酸酶（U/L）IL-6[M（P25，P75），pg/mL]TNF-ɑ[M（P25，P75），pg/mL]IL-10（pg/mL）TGF-β1（ng/mL）肝泡型包虫病（n=30）12（40.0）18（60.0）43.10±13.01 24（80.0）6（20.0）21（70.0）9（30.0）147.85±76.53 112.59±45.86 28.16±4.37 199.20±56.95 16.79（0.83，47.14）8.95（0.23，27.42）9.74±5.78 4.81±0.67健康人群（n=30）15（50.0）15（50.0）45.63±15.67 0（0）30（100.0）16（53.33）14（46.67）23.47±5.84 19.62±5.23 42.40±3.85 69.34±21.45 5.23（0.45，14.27）1.62（0.18，15.48）8.93±5.32 3.92±0.45 t/χ2值0.606 0.680 40.000 1.763 8.876 11.032 13.392 11.688 28.974 19.405 0.565 6.040 P 值0.436 0.499＜0.001 0.184＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.574＜0.001

表3 肝泡型包虫病患者PL肝组织中M2/M1比值与肝功能的关系Tab.3 Correlation between M2/M1 ratio in PL tissues and liver function of AE patients

本研究发现肝泡型包虫病病灶邻近肝组织中存在大量炎症细胞浸润，且CD86+巨噬细胞阳性表达率明显高于N肝脏组织，另外PL肝组织中CD206+M2型巨噬细胞阳性表达率明显高于N肝脏组织，而PL肝组织和N肝组织中M1型巨噬细胞的阳性表达率比较基本无明显统计学差异。说明在PL肝组织中以M2型巨噬细胞浸润为主。有研究表明多房棘球蚴可诱导宿主机体产生免疫效应[12]，一方面抵抗病原体引起的组织损伤；另一方面也有助于虫体在宿主肝脏内增殖和成熟，从而完成其生活史。对宿主来说，免疫系统能限制棘球蚴所导致的机体病理变化的发展[13]。巨噬细胞是机体免疫应答中必不可少的、具有高度组织异质性的免疫细胞之一，在肝脏组织中称之为库普弗细胞[14]。被不同信号刺激可分化为经典途径激活的M1型巨噬细胞和替代途径激活的M2型巨噬细胞。王东旭等[15]通过建立小鼠泡型包虫病模型发现，AE 小鼠模型血清中CD16/32+M1型巨噬细胞和CD206+M2型巨噬细胞百分比均明显高于对照组小鼠，而且血清IL-6、TNF-α、TGF-β1 等细胞因子的含量也有不同程度增加，进而推测极化后的M1/M2巨噬细胞参与了泡球蚴感染过程，二者的失衡可能导致了该疾病的进展。AE患者PL肝组织中存在M1型和M2型巨噬细胞的双重浸润，尤其以M2型巨噬细胞为主，说明M2型是参与肝泡型包虫病进展的主要免疫细胞类型。

另外，肝泡型包虫病患者PL肝组织中M2/M1型比例与谷丙转氨酶呈正相关性，与白蛋白水平呈负相关性，而且随着Child-Pugh 肝功能分级的升高，M2/M1比值也逐渐增加，从而也证实在一定程度上，肝泡型包虫病患者肝功能损伤越严重，PL肝组织中M2/M1比值越高，巨噬细胞更易向M2型分化。肝脏组织感染AE 早期，首先引起Th1 免疫应答，随着疾病的发展，Th2 免疫应答逐渐占据主导地位[16]。有研究[17]显示，Th1 免疫应答可增加M1型巨噬细胞的数量，进而分泌IL-6、TNF-α等炎症因子，以清除病原微生物；但是临床上多数患者确诊时已处于AE 感染的中晚期阶段，巨噬细胞逐渐向M2型转化，通过分泌IL-10、TGF-β1 等因子，抑制机体Th1 免疫应答[18]。在本研究中，经ELISA检测结果显示，除IL-10 外，IL-6、TNF-α、TGF-β1 等因子在肝泡型包虫病患者血清均有不同程度地增加，这也进一步证实，AE 可通过表达某些细胞因子或蛋白激活Th2 免疫应答，使得巨噬细胞趋向于M2型转化，通过分泌IL-10、TGF-β1 等，协助AE逃脱宿主地免疫攻击。AE 早期临床症状不明显，多数患者确诊时已出现局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死，甚至发生肺、脑、乳腺等器官转移[19]，而且并发症较多。多房棘球蚴作为外源性异物，抗原成分复杂，一方面可引起机体正常的免疫应答，促使巨噬细胞向M1型分化，分泌IL-6、TNF-α等协助机体清除病原体；另一方面，可能通过免疫逃逸机制逃避免疫系统的防御清除功能，促使巨噬细胞向M2型转化，并分泌IL-10、TGF-β1 等因子，抑制机体免疫系统过度活化[20]，因此血清中IL-6、TNF-α、TGF-β1 等因子都有不同程度的增加，但是仍然以M2型巨噬细胞分化为主。

综上所述，肝泡型包虫病患者病灶邻近肝组织中存在大量CD86+巨噬细胞浸润，且以CD206+M2型巨噬细胞为主，同时患者血清中除IL-10 外，IL-6、TNF-α、TGF-β1 等因子均有一定程度地升高，说明M2型巨噬细胞在肝泡型包虫病发展过程中发挥着重要作用。