酪蛋白激酶2 相互作用蛋白1 对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

秦青， 宋杨， 刘佳， 李强

1. 西安交通大学第二附属医院（西北医院）口腔科，陕西西安（710003）； 2. 解放军第986 医院口腔科，陕西 西安（710054）； 3. 军事口腔医学国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 陕西省口腔疾病临床医学研究中心 第四军医大学口腔医院正畸科，陕西 西安（710032）； 4. 军事口腔医学国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 陕西省口腔疾病国际联合研究中心 第四军医大学口腔医院急诊与综合临床科，陕西西安（710032）

牙周骨量丧失是牙周炎患者牙齿松动、缺失的重要原因之一。因此，维持牙周现有骨量或逆转牙周骨量丧失成为牙周炎治疗的研究热点。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）作为人牙周组织中重要的干细胞来源，其成骨分化能力对牙周骨量的维持具有重要作用［1］。酪蛋白激酶2 相互作用蛋白1（casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1）是新发现的一种重要的骨形成负调控因子。有研究显示，下调CKIP-1 既可促进成骨细胞的成骨能力，又可促进骨髓间充质干细胞的成骨向分化进程；应用CKIP-1 特异性siRNA 可对多种骨质疏松动物模型产生逆转骨量丧失的作用［2-3］。另有研究也显示，CKIP-1 的下调可以减轻实验性牙周炎大鼠的牙周骨量丧失程度［4］，但具体机制尚未阐明。本研究将通过siRNA 干扰技术下调hPDLSCs 内的CKIP-1 水平，观察CKIP-1 对hPDLSCs 的成骨分化能力及成骨相关因子的表达影响，并探索骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路的调控功能，以期为CKIP-1 特异性siRNA 应用于牙周炎临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α-MEM 培养基、100 mL/L 新生牛血清（Gibco，美国）；10 g/L 青霉素/链霉素、引物、CKIP-1 siRNA慢病毒、CKIP-1 过表达慢病毒（GeneRay，上海吉凯）；成骨诱导液（第四军医大学口腔医院组织工程中心）；RNA 提取试剂盒（RNAiso Plus，Takara，日本）、实时荧光定量PCR 试剂盒（Takara，日本）；茜素红染色及定量检测试剂盒（上海生工）；分光光度计（BioTek，美国）；实时定量PCR 仪（Applied biosystems，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 hPDLSCs 原代培养 选取第四军医大学口腔医院门诊因正畸需要拔除的牙体完整、无畸形、无牙体及牙周组织疾病的第二前磨牙40 个，分别来自20 例身体健康者，年龄15～22 岁。牙拔除后立即用0.01 moL/L PBS 冲洗，无菌条件下，用锐利刀片刮取根中1/3 区域的牙周膜组织，并将其切割成约1 × 1 mm3的小块，并放置于6 孔板中（含150 mL/L FBS、0.292 mg/mL 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素及链霉素的α-MEM 培养基），在37 ℃、5% CO2及饱

和湿度条件下培养，每2 d 换液1 次，细胞从组织块边缘爬出后继续培养7 d；待细胞生长融合至80%时，用胰酶/EDTA（0.25/0.1，pH＝6.4）消化传代。本研究进行实验的hPDLSCs 细胞均为P4 代。

1.2.2 hPDLSCs 鉴定 取培养的P4 代hPDLSCs，调整细胞密度为1 × 106/mL，用40 g/L 多聚甲醛固定15 min；PBS 洗涤后分别加入鼠抗人CD105 单抗，室温孵育1 h；再经PBS 洗涤后分别加入羊抗鼠Ig-FITC，室温避光贮存45 min；流式细胞仪检测细胞表面CD105 的表达水平。hPDLSCs 经过成骨诱导液诱导培养21 d 后，40 g/L 多聚甲醛固定细胞1 h，PBS 清洗3 次后，茜素红染色20 min，再用PBS 洗去多余染色剂，光镜下观察矿化结节形成情况，鉴定hPDLSCs 细胞的多向分化能力。

1.2.3 分组及慢病毒感染 取hPDLSCs 接种于培养板中，调整细胞密度为5 × 104个/mL，并将其分为4 组：①空白对照组（Con）：细胞不感染任何慢病毒；②阴性对照组（shNC）：细胞感染空白质粒慢病毒；③CKIP-1 siRNA 组（CKIP-1 siRNA）：细胞感染CKIP-1 siRNA 慢病毒；④CKIP-1 组（CKIP-1）：细胞感染CKIP-1 过表达慢病毒。感染方法：待细胞融合至80%时进行慢病毒感染，期间选用感染增强液提高感染效果。6 h 后换液，72 h 后进行收集细胞。将细胞按1 × 105个/孔的浓度接种于6 孔板中，无双抗培养基培养。

1.2.4 茜素红染色及矿化结节的定量分析 取上述分组P4 代hPDLSCs，分别经成骨诱导液诱导培养21 d 后，进行茜素红染色并于镜下观察矿化结节形成情况；再取100 g/L 氯化十六烷基1 mL 室温下吹打30 min 至钙化结节完全溶解，吸取上清液300 μL，用紫外分光光度计562 nm 波长下测量A 值［5］。1.2.5 qPCR 检测成骨调控因子和BMP 信号通路相关因子mRNA 水平 首先，分别取各组成骨诱导培养21 d 的细胞，经PBS 洗涤并离心后，调整细胞密度为1 × 105个/mL，取1 mL，用Trizol 裂解各组hPDLSCs，分离RNA，并利用其作为模板进行反转录成cDNA，其中反转录所得cDNA 保存于-20 ℃冰箱中以防分解。按照Takara 公司的qPCR 试剂盒要求，加入上下游引物，利用qPCR 仪进行反应，合成所设计的相关基因。对照基因选择为β-actin，用2-ΔΔCt法统计分析各组间成骨相关因子Runt 相关转 录 因 子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator ofnuclear factor kappa-B ligand，RANKL）和I 型胶原（type I collagen，Coll I）的转录水平的差异，以及BMP 信号通路相关因子BMP2、泛素连接酶1（Smad ubiquitination regulatory factor 1，Smurf1）和Smad 家族成员4（mothers against decapentaplegic homolog 4，Smad4）水平差异。反应条件：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃30 s，40 个循环。引物序列见表1。

表1 基因名称和引物序列Table 1 The gene name and primer sequence

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对所有数据进行统计分析。统计软件绘制P-P 图验证数据正态性，单因素方差分析法验证数据方差齐性。计量资料结果以x±s表示，两组比较使用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q 法，并应用Bonferroni 进行事后检验。以α＝0.05 为检验水准。

2 结 果

2.1 hPDLSCs 的鉴定

培养细胞形态呈长梭形类似成纤维样细胞（图1 a、b），茜素红染色可见矿化结节（图1c），且阳性表达间充质干细胞表面标记物CD105（图1d），符合hPDLSCs 表型特征。

2.2 慢病毒感染后hPDLSCs 的CKIP-1 mRNA 水平

Figure 1 Identification of hPDLSCs图1 hPDLSCs 的鉴定

CKIP-1 si-RNA 水平方差齐性检验显著性值为P＝0.234，满足方差齐性，可采用单因素方差分析。qPCR 结果（图2）显示，空白对照组与阴性对照组内CKIP-1 转录水平无明显差异（P＝0.319），CKIP-1 siRNA 组CKIP-1 mRNA 转录水平较阴性对照组显著降低（P＝0.000），CKIP-1 过表达组CKIP-1 转录水平较阴性对照组显著升高（P＝0.000）。

Figure 2 mRNA expression of CKIP-1图2 CKIP-1 mRNA 表达水平

2.3 慢病毒感染后对hPDLSCs 成骨分化能力的影响

各组hPDLSCs 经21 d 成骨诱导培养后，茜素红染色结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，CKIP-1 siRNA 组具有更多的矿化结节，CKIP-1 过表达组成骨结节形成较少。用分光光度计法对矿化结节进行定量分析，矿化结节定量分析数据水平方差齐性检验显著性值为P＝0.145，满足方差齐性，可采用单因素方差分析。统计结果显示，可见CKIP-1 siRNA 组细胞光吸收值更高（P＝0.036，vs.空白对照组；P＝0.038，vs.阴性对照组；P＝0.030，vs.CKIP-1 组），CKIP-1 过表达组吸光度值更低（P＝0.032，vs.空白对照组；P＝0.033，vs.阴性对照组；P＝0.030，vs.CKIP-1 组），说明CKIP-1 siRNA组细胞成骨分化效果更为显著（图3）。

2.4 成骨相关调控因子水平

Figure 3 Alizarin red staining and quantitative detection of the osteogenic differentiation ability of hPDLSCs图3 茜素红染色及定量检测hPDLSCs 成骨分化能力

成骨相关调控因子水平数据方差齐性检验显著性值均P＞0.05，满足方差齐性，可采用单因素方差分析。qPCR 结果显示（图4），CKIP-1 siRNA组细胞成骨相关调控因子Runx2（P＝0.032）、ALP（P＝0.028）、OCN（P＝0.032）的转录水平均高于阴性对照组细胞，CKIP-1 过表达组成骨相关调控因子Runx2（P＝0.042）、ALP（P＝0.040）、OCN（P＝0.042）表达下降；同时，Coll I 作为成骨过程中的主要胶原纤维，CKIP-1 siRNA 组转录水平显著升高（P＝0.026），而RANKL 作为破骨细胞分化的重要指标，CKIP-1 siRNA 组转录水平未见明显变化（P＞0.05）。提示CKIP-1 的作用主要针对hPDLSCs的成骨分化过程。

Figure 4 mRNA expresssion level of osteogenic regulatory factors图4 成骨相关调控因子mRNA 表达水平

2.5 BMP 信号通路检测

BMP 信号通路相关分子数据方差齐性检验显著性值均P＞0.05，满足方差齐性，可采用单因素方差分析。qPCR 结果（图5）显示，与对照组比较，CKIP-1 siRNA 组的BMP 信号通路相关因子BMP2（P＝0.010）、Smurf1（P＝0.017）和Smad4（P＝0.013）mRNA 水平有显著提高，而CKIP-1 组BMP2（P＝0.032）、Smurf1（P＝0.026）和Smad4（P＝0.022）明显下降，提示CKIP-1 可能通过影响BMP 信号通路活性，对hPDLSCs 成骨向分化进程产生影响。

3 讨 论

hPDLSCs 作为人牙周组织重要的干细胞来源，对牙周组织抵抗炎症、维持骨量、损伤修复等生理功能起到重要作用［6-7］。其中，hPDLSCs 的成骨分化能力对健康牙周组织的骨量维持、牙周炎状态下的骨量保护、治愈状态下骨量恢复均具有重要作用［8-9］。在一系列生理过程中，多种信号通路与细胞调节因子参与其中，可调控某些关键因子的含量或功能，进而促进hPDLSCs 的成骨分化能力。

Figure 5 mRNA expression level of BMP signal pathway related factors图5 BMP 信号通路相关因子mRNA 表达水平

CKIP-1 具有高度的保守性，动物与人的CKIP-1 基因及蛋白极为相似，为CKIP-1 基础研究向临床转化提供了良好基础。同时，CKIP-1 广泛分布于机体中，在细胞生存、周期调控、细胞骨架形成和维持、蛋白细胞内转运与亚细胞分布等多方面具有重要作用［10-12］。其中，CKIP-1 对于骨组织形成的负向调控作用也是研究关注的重点。研究显示，CKIP-1 基因全身性敲除的小鼠相较于同窝、同性别的野生型小鼠具有更高的骨密度，且该作用随年龄增长而越发显著［13］。学者通过过量糖皮质激素注射［3］和尾悬吊［14］等多种方法，分别制备了CKIP-1 基因敲除小鼠的激素性和失重性（或称废用性）骨质疏松模型。结果显示，CKIP-1 基因敲除可部分改善上述类型骨质疏松小鼠的骨量丢失症状，影像学检测可见CKIP-1 基因敲除小鼠长骨松质骨区域骨量得到有效维持。还有研究显示，miR-980可以通过干扰CKIP-1 提高成骨细胞成骨能力［18］。

另有研究显示，CKIP-1 在成骨细胞中主要通过BMP 信号通路起作用。CKIP-1 可通过促进E3泛素连接酶Smurf1 的作用，提高其与底物的亲和力，从而使BMP 关键的下游分子Smads 分解，进而抑制BMP 信号通路作用。而敲除或下调CKIP-1 表达水平可促进BMP 信号通路作用，从而发挥促进成骨细胞分化及成骨功能的发挥［15-16］。研究显示，CKIP-1 基因敲除小鼠的骨髓间充质干细胞成骨分化进程显著加快，从而对长骨骨量维持起调控作用［2］。目前，CKIP-1 对于骨组织影响的研究主要集中于肢体长骨松质骨部分，而其对颌骨组织，尤其是牙周骨组织的影响报道较为有限［17］。研究显示，下调CKIP-1 表达水平可在一定程度上缓解鼠牙周炎骨量丧失［4］，而CKIP-1 是否能影响hPDLSCs的成骨分化能力，进而在牙周骨量维持中起长期作用尚未报道。

本研究显示，下调hPDLSCs 内CKIP-1 转录水平可有效提高细胞中矿化结节的产生，促进hPDLSCs成骨分化进程，下调CKIP-1 转录水平对hPDLSCs 成骨分化具有单方面的积极作用。此外，BMP 信号通路也是参与CKIP-1 调控hPDLSCs 成骨分化的重要分子机制。

总之，hPDLSCs 是牙周组织骨量维持的重要细胞基础，下调CKIP-1 可以有效促进hPDLSCs 成骨分化能力。CKIP-1 对于牙周组织骨量的调控作用，为通过组织工程的方法治疗牙周炎提供了新思路及实验依据。