杨木应拉木微区结构可视化及化学成分分析

朱玉慧，闻靓，张耀丽，王新洲

（南京林业大学材料科学与工程学院，南京 210037）

应拉木是一种广泛存在于阔叶材倾斜或弯曲树干和枝条上方的非正常木材，其木纤维细胞壁中常存在着一层特殊的胶质层（G 层）。由于胶质木纤维的存在，应拉木在加工过程中极易起毛，且难于干燥，易干缩、翘曲和开裂，利用范围也受到了很大的限制。因此，开展应拉木基础理论研究对应拉木材性改良和利用具有重要的现实意义。

因应拉木特殊的结构，学者们对其作了很多研究。Goswami 等［1］为了描述胶质层和次生细胞壁之间的功能相互依赖关系，对杨木应拉木木纤维和去除胶质层的木纤维分别进行了纳米结构表征和力学测试。周亮等［2］对欧美杨107 应拉木和正常木的纤维形态和化学组成做了比较研究。苌姗姗等［3］利用氮气吸附法对杨木应拉木的孔隙结构进行了表征。同时，学者们也对胶质层及其与生长应力之间的关系作了大量的研究［4-5］。

杨木由于其生长周期短、成材速度快、纹理直、结构均匀等优点，成为我国主要的速生材，并且在木材工业中的应用越来越广。但杨木极易受到环境和重力的影响，产生应拉木。笔者以无性系杨木（Populus deltoidesCL.‘Nanyang’）应拉木为研究对象，采用荧光显微、拉曼成像等技术研究杨木应拉木微区结构和化学成分，以期为了解杨木应拉木的宏观性质提供理论根据，从而减少因杨木应拉木缺陷造成的损失并提高其利用率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材取自河南省焦作市林场，10 年生无性系杨木（P.deltoidesCL.‘Nanyang’）应拉木，在树木倾斜处锯取2 cm 厚的圆盘，并沿圆盘的南北向锯取2 cm 宽木条（年轮明显偏宽处为应拉区，另一侧为对应区），待用。

1.2 光学及荧光显微镜分析

在试样的应拉区和对应区分别截取小木块并软化，滑走切片机切取厚10 和20 μm 的切片。10 μm 的切片直接利用OLYMP US BX51 荧光显微镜进行横切面细胞壁木质素浓度的分析；20 μm 的切片采用番红-固绿双染色法，酒精梯度脱水，甘油封片，OLYMPUS BX51 显微镜观察样品横切面。

1.3 透射电镜分析

在试样的应拉区和对应区分别截取1 mm×1 mm×2 mm 的小木条，1%的高锰酸钾染色30 min，丙酮梯度脱水，Epon-812 树脂包埋，烘箱70 ℃固化7 h。固化完全的试样用超薄切片机切取厚50～100 nm 的切片，透射电子显微镜JEM-1400 观察分析。

1.4 区域化学分析

在试样的应拉区和对应区分别截取小木块并软化，滑走切片机切取厚5 μm 的切片，置于载玻片上滴加适量重水，盖玻片封片。利用显微拉曼成像光谱仪DXRxi 进行观察分析，波长532 nm。

1.5 主要化学成分含量测定

采用美国可再生能源实验室（NREL）的标准方法［6］测定绝干样品中纤维素、半纤维素和木质素含量。其中，纤维素和半纤维素含量通过高效液相色谱仪测定，酸溶木质素由紫外分光光度计测定，酸不溶木质素由高温热解的方法测定。

1.6 红外光谱测定

磨粉机将试样磨成木粉，筛选通过孔径为0.18 mm 的木粉，采用溴化钾压片法，红外光谱仪VERTEX 80V，Bruker 分析，扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数为16 次。

1.7 相对结晶度和晶体尺寸测定

筛选通过孔径0.075 mm 的木粉，X 射线衍射仪测定样品。采用Cu 靶Kα 辐射（λ=0.154 06 nm），电压40 kV，电流30 mA，扫描范围2θ为5°～45°，步长0.02°，扫描速度2°／min。采用Segal 公式计算样品的相对结晶度（CrI）：

式中：I002为在2θ=22°附近（002）晶面衍射峰的最大强度；Iam为在2θ=18°附近处的无定形区域的衍射峰强度。

根据谢乐公式（Scherrer formula）［7］，计算晶体平均尺寸（D）：

式中：K为形状因子，一般取0.9；λ为X 射线波长，λ=0.154 06 nm；θ为衍射角；Bhkl为以弧度计算的（002）晶面或（040）晶面半峰宽。一般（002）晶面用来描述纤维素晶体的宽度，（040）晶面用来描述纤维素晶体的长度，单位为nm。

2 结果与分析

2.1 杨木木纤维微观构造分析

无性系杨木应拉区和对应区木纤维光学图见图1。由图1 可知，经过番红固绿双染色后，杨木应拉区木纤维细胞壁中呈绿色的胶质层（G）清晰可见，其余部位呈紫红色；对应区木纤维则完全呈现红色。应拉区中胶质层与次生壁产生了脱离，且部分存在褶皱，见图1a；而在对应区中无任何分离的现象，见图1b。胶质层的分离是由于传统显微制片过程中产生的“边界效应”，但当切片厚度大于100 μm 时，胶质层的分离现象将不会出现［8］。

图1 杨木木纤维显微构造图Fig.1 Optical microscope in fibers of poplar wood

2.2 杨木木纤维荧光显微分析

木材中木质素的浓度与其自发光强度成正比，故可直接利用荧光显微镜显示细胞壁中木质素的分布情况。无性系杨木应拉区和对应区木纤维荧光图见图2。由图2 可知，杨木应拉区和对应区木纤维荧光强度最高处都为细胞角隅（CC）处，其次为复合胞间层（CML），这是由于木纤维细胞木质化是由细胞角隅开始，且在细胞角隅和胞间层沉积大量木质素。且杨木应拉区木纤维中除了胶质层（G）外，其余壁层荧光强度的强弱规律（图2a）与对应区木纤维（图2b）一致，这表明其他壁层的木质化并不受胶质层的影响，与对应区木纤维的木质化过程一致，且木质化程度极高［9］。应拉区木纤维细胞壁中特有的G 层荧光强度较弱，表明胶质层的木质素浓度较低。前人对胶质层化学成分的研究初期认为，其仅由高结晶度的纤维素组成，且微纤丝角小［10］。随着实验技术的进步，多种方法都证实胶质层中存在少量木质素［11-13］。

图2 杨木木纤维荧光图Fig.2 Fluorescence microscope in fibers of poplar wood

2.3 杨木木纤维透射电镜分析

在形成层细胞活动期，原始细胞通过分裂形成新的细胞，随后初生壁（P）在胞间层两侧沉积。在细胞生长末期，新的纤维素微纤丝开始在初生壁内侧不断沉积，逐渐加厚形成次生壁外层（S1）、次生壁中层（S2）、次生壁内层（S3）。而在细胞壁形成的过程中，若树木生长受到外界的影响，则会在靠近细胞腔的内侧生成胶质层（G），从此形成胶质木纤维，通常形成以下3 种结构：P+S1+S2+S3+G，P+S1+S2+G 和P+S1+G［14］。无性系杨木应拉区和对应区木纤维透射电镜图见图3。由图3 可见，无性系杨木应拉区木纤维的次生壁结构为常见的S1+S2+G 结构，未见S3层，对应区木纤维细胞壁次生壁壁层结构则为S1+S2+S3。

图3 杨木木纤维透射电镜图（5 000 倍）Fig.3 Transmission electron microscope in fibers of poplar wood （5 000×）

应拉区木纤维细胞（图3a）中S1层、S2层和G层区分明显。其中，S1层和S2层的平均厚度分别为0.61 和1.22 μm，G 层的平均厚度为2.53 μm，占纤维壁的比例最大，为应拉木纤维细胞中最厚的壁层。对应区木纤维细胞（图3b）中S1层和S2层清晰可见且区分明显。其中，S1层的厚度（0.15～0.64 μm）在单个细胞内和所有细胞内都是多变的，其平均厚度为0.33 μm。最宽的S2层占纤维壁的比例最大，平均厚度为2.28 μm。木纤维中也存在S3层，但是，S3层厚度较薄（0.08～0.21 μm），平均厚度为0.14 μm，且并非在所有细胞中都清晰可见。与对应区相比，应拉区木纤维中G 层为最厚层，S1层的厚度增大，S2层的厚度减小，整体厚度增大。

2.4 区域化学的可视化分析

由于木质素芳香环的对称伸缩振动会在1 600 cm-1产生非常明显的拉曼特征峰，因此对1 600 cm-1位移处进行积分便可得到木质素的拉曼成像［15］。选定区域的杨木应拉区与对应区在细胞壁中木质素分布的光镜和拉曼成像见图4。颜色越明亮的区域说明拉曼信号强度越高，则表示细胞壁中木质素的浓度越高；相反颜色越暗，木质素浓度越低。从图4a 可见，G 层在光镜下清晰可见处于木纤维最内层；而在图4b 中G 层，所在位置颜色较暗，表明G 层木质素的相对含量较低，且各壁层木质素相对含量存在一定差异。由图4b 和4d 可知，杨木应拉区与对应区的木质素的分布规律基本一致，在CC 和CML 处沉积了大量木质素，其中CC处的木质素含量最高，在次生壁S 中的木质素含量相对较低，且在细胞壁中的木质素的相对含量应拉区要明显低于对应区。

图4 杨木细胞壁中木质素的光镜图和拉曼成像图Fig.4 Optical micrographs and Raman images of lignin in the cell wall of poplar wood

2.5 杨木试样主要化学成分含量分析

杨木应拉区和对应区的主要化学成分含量见表1。由表1 可知，杨木应拉区与对应区两者相比，化学组成含量具有明显差异。应拉区中纤维素的含量明显比对应区高，半纤维素和木质素含量则比对应区低，这也与前人的研究一致［10，16］。杨木应拉区与对应区化学成分明显不同的原因在于应拉区中存在大量的胶质木纤维。胶质木纤维细胞壁结构上具有特殊的G 层，且G 层厚度大于其他壁层。胶质层主要是以纤维素微纤丝的形态构成骨架结构，骨架间隙由多糖基质填充，含有少量木质素，且化学成分与相邻壁层存在很大差异［9］。

表1 杨木应拉区和对应区的主要化学成分含量Table 1 Content of main chemical composition of poplar tension wood and opposite wood %

2.6 红外光谱图分析

杨木应拉区和对应区的红外光谱图见图5。由图5 可知，应拉区木材与对应区木材两者红外光谱图具有明显差异。应拉区在1 594 和1 509 cm-1处的苯环碳骨架振动（木质素）［7，17］吸收峰强度明显低于对应区，这说明在应拉区中木质素的含量低于对应区。在1 730 cm-1附近的C═O 伸缩振动（半纤维素乙酰基CH3C═O）是半纤维素区别于其他组分的特征［7］，图中显示应拉木在此处强度减弱，这表明应拉区木材的半纤维素含量与对应木相比降低，与NREL 法的化学成分定量分析结果一致。

图5 杨木应拉区和对应区的红外光谱图Fig.5 Infrared spectrogram of tension wood and opposite wood

2.7 杨木试样相对结晶度和晶体尺寸

杨木应拉区和对应区木材的X 射线衍射图见图6。典型的（101）、（002）和（040）特征晶面的出现表明杨木应拉区和对应区的结晶类型都属于典型的纤维素Ⅰ晶型［7］。利用Segal 法测得的杨木应拉区和对应区的相对结晶度分别为48.06%和41.01%，应拉区的结晶度明显比对应区高。这是由于应拉区中存在大量胶质木纤维，其中G 层的微纤丝倾角基本与树轴方向平行，同时木质素和半纤维素等不定型高聚物含量减少，使得纤维素结晶度增加［16］。利用谢乐公式得出：杨木应拉区的晶区宽度为2.66 nm，长度为8.84 nm；对应区的晶区宽度为2.65 nm，长度为9.87 nm。根据正常天然纤维素的晶胞参数c=0.78 nm，可推断杨木应拉区和对应区纤维素晶区宽度均由3 个晶胞构成。因为晶胞参数b=1.03 nm，所以杨木应拉区和对应区纤维素晶区长度分别由8 个和9 个晶胞构成。从数据可见，杨木应拉区与对应区纤维素结晶区尺寸的差异并不显著。

图6 杨木应拉区和对应区木材的X 射线衍射图Fig.6 X-ray diffraction pattern of tension wood and opposite wood

3 结论

1）杨木应拉区木纤维细胞壁中存在特殊的G层，细胞壁结构为P+S1+S2+G，对应区则为典型的P+S1+S2+S3。应拉区木纤维中G 层（2.53 μm）最厚，对应区则为S2层（2.28 μm）。与对应区木纤维相比，应拉区木纤维S1层（0.61 μm）的厚度增大，S2层（1.22 μm）的厚度减小，整体厚度增大。

2）杨木应拉区木纤维CC 处的木质素浓度最高，其次为CML，然后为S 层，浓度最低的壁层为G层，对应区木质素浓度与应拉区的规律基本一致；应拉区木质素相对含量低于对应区。杨木应拉区与对应区红外光谱具有明显差异，应拉区在1 594，1 509 和1 730 cm-13 处的吸收峰强度都明显低于对应区，说明应拉区木材有较低的半纤维素和木质素含量；同时三大素含量也表明杨木应拉区木材具有典型的高纤维素含量、低半纤维素和木质素含量的特征。

3）杨木应拉区木材的结晶度为48.06%，高于对应区的41.01%，而在晶体尺寸方面的差异并不明显。