来源于解酯菌的嗜热耐碱脂肪酶的表达纯化及其酶学性质研究

许蕊，张昕怡，潘悦，张瑜，李迅，王飞

（南京林业大学化学工程学院，江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，南京 210037）

脂肪酶（EC 3.1.1.3），又称三酰基甘油酯水解酶，其广泛存在于动植物和微生物中，可以用于催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应［1-2］。由于其具有高反应活性、较强的底物特异性等优点，被广泛应用于食品、医药、日化、洗涤剂等行业［3-4］。嗜热耐碱的脂肪酶能够在高温和碱性条件下进行催化反应，扩大了脂肪酶的应用范围。目前，来源于厌氧嗜热耐碱菌脂肪酶的报道不多，因此对嗜热耐碱脂肪酶的酶学性质研究也相对匮乏。解酯嗜热菌（Thermosyntropha lipolytica）来源于肯尼亚碱性温泉，是一种厌氧、嗜热、耐碱的细菌［5］。从该细菌中分离得到的脂肪酶在极端高温和碱性条件下，仍能够保持较高的稳定性和催化活性［6］，具有极大的应用前景。

油酸乙酯是高级脂肪酸醇酯，主要用作润滑剂、表面活性剂、软膏基质、抗水剂、食品添加剂、柴油添加剂等，已被广泛应用于纺织、医药、日化、食品等行业中［7-8］。目前工业化生产油酸乙酯主要是以十二烷基苯磺酸或浓硫酸为催化剂，在高温高压下催化油酸和乙醇酯化［9］。该法需在高温、高压、强酸等条件下进行，对设备腐蚀严重，且副反应多，后处理步骤繁琐，生产成本较高［10］。然而，采用酶法制备油酸乙酯能够弥补化学法的不足，尤其是嗜热耐碱脂肪酶，其具有较好的热稳定性及较宽的pH 适用范围，能够在高温下制备油酸乙酯，且酶转化的专一性强，极大地提高了催化效率。笔者以全基因合成的方法获得来源于解酯嗜热菌的脂肪酶（TlLip2）基因，将其克隆至大肠杆菌表达载体pET28a 中，并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达，测定了重组脂肪酶TlLip2 的酶学性质，并将其应用于油酸乙酯的合成研究中。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌Top 10F’和BL21（DE3）菌株由江苏省物质绿色燃料与化学品重点实验室保存。大肠杆菌表达载体pET28a 购自德国Novagen 公司。全基因合成和基因测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.1.2 试剂

胰蛋白胨（Tryptone） 和酵母提取物（yeast extract）购自英国Oxoid 公司；常用生化试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）、卡那霉素（Kan）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）等购自德国Biofroxx 公司；对硝基苯乙酸酯（p-nitrophenyl acetate，C2）、对硝基苯己酸酯（p-nitrophenyl caproate，C6）、对硝基苯辛酸酯（p-nitrophenyl octanoate，C8）、对硝基苯月桂酸酯（p-nitrophenyl dodecanoate，C12）、对硝基苯肉豆蒄酸酯（p-nitrophenyl myristate，C14）和对硝基苯棕榈酸酯（p-nitrophenyl palmitate，C16）等购自美国Sigma 公司；质粒小量提取试剂盒购自英国Axygen 公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）购自美国Aladdin 公司；其他生化试剂及药品均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB（Luria-Bertani）培养基、固体LB 培养基、SOC（super optimal broth with catabolite repression）培养基等配方同参考文献［11］。

1.2 试验方法

1.2.1TlLip2 的克隆

根据密码子使用频率数据库信息（codon usage database），对来源于解酯嗜热菌脂肪酶的氨基酸序列（Genbank： SHG41589.1）按大肠杆菌优势密码子偏好性进行优化，通过全基因合成获得其基因片段。采用限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ分别对TlLip2 的基因片段tll2 和载体pET28a 进行双酶切后连接，42 ℃下热击转化大肠杆菌Top 10F’。经核酸电泳验证后，获得正确的重组质粒pET28a-TLL2。

1.2.2TlLip2 的诱导表达

将构建的重组质粒pET28a-TLL2 热击转化至大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落接入含卡那霉素（30 mg／L）的LB 培养基中，37 ℃振荡培养至菌体浓度达到使OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.5 mmol／L 的IPTG，25 ℃诱导表达24 h。离心收集菌体，用5 mmol／L 咪唑缓冲液（pH 为7.9）重悬。

1.2.3TlLip2 的分离纯化

超声破碎重悬的大肠杆菌细胞，离心收集上清液即为粗酶液。粗酶液在50 ℃水浴锅内热处理15 min，去除非耐热杂蛋白，离心收集上清液即为热处理后的酶液。将热处理后的酶液通过Ni2+亲和柱纯化，用不同梯度的咪唑洗脱缓冲液（pH 为7.9）进行洗脱，纯蛋白主要存在于250 mmol／L 咪唑缓冲液中。采用质量分数为12%的分离胶SDSPAGE 分析重组蛋白的表达及纯化效果。

1.2.4TlLip2 的酶活力测定方法

参考文献［12］的方法，以10 μL 20 mmol／L 对硝基苯棕榈酸酯（p-NP-C16）为底物，加入180 μL 50 mmol／L Tris-HCl 缓冲液（pH 为8.0），在60 ℃下保温5 min 后，加入10 μL 热处理后的酶液，准确反应10 min，加入600 μL 终浓度为1 mol／L 的Na2CO3溶液终止反应，将反应液在室温下离心后，取上清，在400 nm 处测定吸光值，以释放的对硝基苯酚的量计算酶活。一个酶活单位（U）定义为：在pH 8.0，60 ℃条件下，1 min 内释放1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量。蛋白浓度采用Bradford 法测定［13］。

1.2.5TlLip2 的酶学性质测定

在pH 8.0 下，测定25～95 ℃下的酶活，最高反应酶活力所处温度即为酶的最适反应温度。在最适温度下，分别测定pH 3.0～9.0 下的酶活，最高反应酶活力所处的pH 为酶的最适反应pH。在最适pH下，将酶置于55，60，62，70 ℃下分别保温0，30，60，90，120 min，测定TlLip2 的温度稳定性，以未保温的酶活力为100%计算相对酶活力。将TlLip2 置于pH 4.0～11.0 的缓冲液中，于25 ℃保存60 min，测定TlLip2 的pH 稳定性，以未经缓冲液保温处理的TlLip2 的酶活力为100%计算相对酶活力。

测定金属离子及化学试剂对酶活力的影响时，在酶活测定体系中分别加入终浓度为1 mmol／L 的K+、Na+、Fe3+等金属离子和SDS、EDTA、PMSF 等化学试剂，以不加金属离子和化学试剂的TlLip2 的酶活力为100%计算相对酶活力。

测定底物特异性时，在酶活测定体系中分别加入终浓度为1 mmol／L 对硝基苯乙酸酯（p-NPC2）、对硝基苯己酸酯（p-NP-C6）、对硝基苯辛酸酯（p-NP-C8）、对硝基苯月桂酸酯（p-NP-C12）、对硝基苯肉豆蒄酸酯（p-NP-C14）和对硝基苯棕榈酸酯（p-NP-C16）作为底物，以测定的最高酶活力为100%计算相对酶活。

测定有机试剂耐受性时，将100 μL 稀释一定倍数的TlLip2 置于100 μL 正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、丙酮、异丙醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲亚砜、四氢呋喃中，于25 ℃保存6 h，以未经过有机溶剂保温处理的TlLip2 的酶活力为100%计算相对酶活力。

测定动力学参数时，在酶活测定体系中加入终浓度为0.25～1.5 mmol／Lp-NP-C16，采用Sigma-Plot 软件的动力学模块拟合米式方程曲线并计算动力学参数Km，Vmax和kcat。以上实验均在最适温度和最适pH 下测定酶活力。

1.2.6 油酸乙酯的制备及检测方法

于具塞茄形瓶中加入一定摩尔比的油酸和乙醇、100 mg 活化的4 Å 分子筛、50 μLTlLip2 酶液（100 U／g 油酸），通入N2作保护气，在60 ℃沙浴中，180 r／min 磁力搅拌反应12 h 后，以乙醇停止反应，用气相色谱检测产物并计算产率。

气相色谱检测条件［14］：采用兰州化学物理研究所PEG20-M 柱，30 m×250 μm×0.25 μm （长×内径×膜厚度），氢火焰离子化检测器，N2作载气，H2作燃气，以空气助燃。柱箱温度为180 ℃，保持2 min，3 ℃／min 程序升温，升至240 ℃，保持10 min，检测温度为260 ℃，载气流速为25 mL／min，进样量为1 μL，分流比［（分流流速+柱体积流速）／柱体积流速］为10 ∶1，以十七烷酸甲酯作内标物检测油酸乙酯产率。

2 结果与分析

2.1 TlLip2 的诱导表达及纯化

将构建的重组质粒pET28a-TLL2 热击转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得表达TlLip2 的重组菌TLL2。重组菌TLL2 经过24 h 的诱导表达后收集菌体，菌体重悬后经超声波破碎、热处理以及镍柱亲和层析后得到纯酶TlLip2，SDS-PAGE 分析如图1 所示。

图1 TlLip2 的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analyses of TlLip2

SDS-PAGE 分析结果表明，诱导的重组菌中具有明显的目的蛋白条带，重组蛋白主要在上清液中，说明目的蛋白以可溶性表达为主。经60 ℃热处理后，一部分非耐热杂蛋白被去除。对TlLip2热处理酶液进行镍柱亲和层析，目的蛋白存在于250 mmol／L 咪唑洗脱液中，亚基分子质量大小约为57 kDa，与目的蛋白的分子质量大小符合。通过热处理和Ni2+亲和柱层析，重组蛋白纯化倍数为12.3，测得纯化后的TlLip2 的比酶活为31 U／mg。

2.2 TlLip2 的酶学性质的测定

2.2.1 最适温度和温度稳定性

在25～95 ℃下测定TlLip2 的最适温度，结果如图2a 所示，TlLip2 的最适温度为60 ℃，随着温度的升高，酶活呈明显下降趋势。在45～70 ℃范围内，TlLip2 的相对酶活均维持在50%以上。温度稳定性结果如图2b 所示，在60 ℃保温2 h 后，相对酶活保持在50%左右，说明TlLip2 在60 ℃以下的温度稳定性较好。Salameh 等［6］从T.lipolytica中分离得到的嗜热耐碱脂肪酶LipB，其最适温度为96 ℃，在100 ℃下保温2 h 后，相对酶活力保持在50%，其最适温度和温度稳定性远高于本研究中的TlLip2，性质差别较大，因此可以说明这两种酶属于不同性质的同工酶。Gumerov 等［15］报道了来源于T.lipolytica的脂肪酶编码基因，并通过大肠杆菌重组表达脂肪酶TSLip1，该酶的最适温度为70 ℃，在80 ℃下保温0～120 min 时，相对酶活先急剧下降随后下降趋势变缓，TSLip1 的最适温度和温度稳定性与TlLip2 相近。

图2 TlLip2 的最适温度及温度稳定性Fig.2 The optimum temperature and temperature stability of TlLip2

2.2.2 最适pH 和pH 稳定性

分别测定pH 3.0～9.0 下的酶活，最适反应pH结果如图3a 所示，结果表明TlLip2 的最适pH 为8.0，且在pH 7.0～11.0 范围内都具有较高活力。pH 稳定性结果如图3b 所示，在pH 4.0～5.0 条件下，酶活丧失较为明显，在pH 6.0～11.0 范围内，TlLip2 的相对酶活均高于60%，说明该酶在碱性条件下具有较好的稳定性。重组脂肪酶TSLip1 的最适pH 和TlLip2 相同，但TSLip1 在pH 4.0～7.0 范围内，相对酶活仅有20%左右［15］，说明TlLip2 的pH 适用范围比TSLip1 更宽。

2.2.3 金属离子及化学试剂对酶活力的影响

在酶活测定体系中分别加入终浓度为1 mmol／L 的金属离子及化学试剂，在最适条件下测定酶活，结果如表1 所示。K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+对TlLip2 的酶活力有促进作用，但促进作用并不十分明显。EDTA 对该重组酶有明显的抑制作用，说明该重组酶TlLip2 可能是金属酶。其他金属离子及化学试剂对TlLip2 的酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Co2+、Zn2+、SDS 和Tween 80 对酶活力抑制作用明显。此外，测定多种类型的表面活性剂对酶活力的影响，但表面活性剂均对酶活力有抑制作用。而从T.lipolytica中分离得到的LipB 是金属酶，在Mn2+的激活作用下酶活力能够提高3 倍［6］。该结果进一步说明LipB 和TlLip2 的酶学性质完全不一样，是不同的脂肪酶。

图3 TlLip2 的最适pH 及pH 稳定性Fig.3 Optimum pH and pH stability of TlLip2

表1 金属离子和化学试剂对酶活的影响Table 1 Effects of cations and chemical reagents on lipase activity

2.2.4 底物特异性

在最适酶活测定条件下，分别加入终浓度为1 mmol／L 不同脂肪酸链长度的对硝基苯酯作为底物，测定结果如图4 所示。TlLip2 对于对硝基苯己酸酯（C6）显示出最大的活力，对于对硝基苯辛酸酯（C8）也显示出较高活性，对于对硝基苯乙酸酯（C2）、对硝基苯月桂酸酯（C12）、对硝基苯肉豆蒄酸酯（C14） 和对硝基苯棕榈酸酯（C16）显示的活力较低。结果表明相比于其他底物，TlLip2 对中等长度的脂肪酸链的底物显示出更高的活性。直接从T.lipolytica中分离得到的LipB 对长链不饱和脂肪酸酯（C18）有较高的活性［6］，重组脂肪酶TSLip1对短链脂肪酸酯（C4、C5）有较高的活性［15］。

图4 TlLip2 的底物特异性Fig.4 Activitiy of TlLip2 toward substrates with different acyl chain lengths

2.2.5 有机溶剂耐受性

TlLip2 的有机溶剂耐受性结果如图5 所示。在正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷中，TlLip2 的残余酶活力均大于100%。在异丙醇、叔丁醇、二甲亚砜中，TlLip2 的残余酶活力保持在80%左右，在叔戊醇中的残余酶活力为60%，在丙酮中的残余酶活力为40%，在四氢呋喃中残余酶活力仅为9%，几乎失活。由此可以说明，TlLip2 的失活程度可能与有机溶剂的极性有关，在异丙醇等中等极性的有机溶剂中，TlLip2 的残余酶活力保持在60%以上，而在丙酮等极性较大的有机溶剂中，酶活受到较大程度的抑制。结果表明，TlLip2 在极性较小的有机溶剂中，耐受性较好，说明其在有机相反应体系中具有较好的应用前景。

图5 TlLip2 的溶剂耐受性Fig.5 Stability of TlLip2 in organic solvent

2.2.6 动力学参数

在酶活测定体系中分别加入终浓度为0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 和1.50 mmol／L 的p-NP-C16，在最适条件下测定酶活力，采用Sigma-Plot 软件中的动力学模块拟合米式方程曲线并计算动力学参数。TlLip2 的Km为0.29 mmol／L，Vmax为2.28 mmol／（L·min-1），kcat为6.19 s-1。Guo 等［16］通过毕赤酵母表达了2 种嗜热重组脂肪酶Aaeol 1 和Aaeol 2，以p-NP-C4 为底物，测定其动力学参数，Km分别为5.11 和0.79 mmol／L，kcat分别为16.12 和3.59 s-1。Cai 等［17］克隆表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的嗜热耐碱脂肪酶LipBA 基因，以p-NP-C16为底物，脂肪酶LipBA 的动力学参数Km和Vmax分别为1.04 mmol／L 和119.05 mmol／（L·min-1）。与其他几种嗜热耐碱脂肪酶相比，TlLip2 具有较好的底物亲和性。

2.3 TlLip2 催化制备油酸乙酯

2.3.1 无溶剂体系中制备油酸乙酯

分别以摩尔比1 ∶1，1 ∶2，1 ∶5加入油酸和乙醇，当酸醇摩尔比为1 ∶2时，油酸乙酯的得率为15.3%，是酸醇摩尔比为1 ∶1时的2 倍，是1 ∶5时的4 倍。这可能是由于酸醇摩尔比为1 ∶1的反应体系中，反应产生的水促进了逆反应，而酸醇摩尔比为1 ∶2时，稍过量的乙醇促进了反应向酯化的方向进行。当酸醇摩尔比达到1 ∶5时，过量的乙醇使TlLip2 失活，导致反应的酯化率过低。邵平等［18］在无溶剂体系中用壳聚糖微球固定化Candida rugosa来源的脂肪酶催化制备油酸乙酯，当酸醇摩尔比为1 ∶2、含水率为8%时，在40 ℃、200 r／min 振荡反应8 h后，油酸乙酯的得率为61.9%，且该脂肪酶经固定化后，催化效果明显提高，在后续工作中，可以考虑对TlLip2 进行固定化，以提高其稳定性和重复使用性。

2.3.2 异辛烷溶剂体系中制备油酸乙酯

无溶剂体系中的酯化率较低，可能是因为底物乙醇和TlLip2 接触几率大，导致酶变性，同时反应产生的水使酯化反应朝着逆反应水解反应进行。TlLip2 的溶剂耐受性较好，在异辛烷中的催化活性几乎不受影响，因此采用异辛烷作溶剂。以摩尔比1 ∶1和1 ∶2 加入油酸和乙醇，酸醇摩尔比为1 ∶2 时，油酸乙酯的得率为62.1%，是酸醇摩尔比为1 ∶1 时的2 倍，酯化率远高于无溶剂体系。分析原因可能是异辛烷溶剂体系使TlLip2 在油水界面被激活，并且在一定程度上缓解了乙醇对酶的抑制作用。高静等［10］以异辛烷为溶剂、CTAB 为表面活性剂、正己醇为助溶剂构建逆胶束体系，用质量浓度为0.1 g／L 的脂肪酶Lipex 催化制备油酸乙酯，当酸醇摩尔比为1 ∶4、水含量（以CTAB 和水的摩尔比表示）为10 时，在25 ℃、150 r／min 振荡反应12 h后，得率为67.4%；反应72 h 后，得率为81.0%。此外，该研究指出在12 h 内，油酸乙酯的得率随时间呈线性增长，当反应12 h 时，该研究中的油酸乙酯得率与本研究相近，但延长时间后得率明显提高，因此，在后续工作中应当探讨油酸乙酯得率与反应时间的关系。

3 结论

1）将全基因合成的来源于解酯嗜热菌T.lipolytica的脂肪酶基因（TlLip2）克隆到大肠杆菌表达载体pET28a 中，获得重组质粒pET28a-TLL2，将pET28a-TLL2 转入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中进行高效表达。经过热处理和镍柱亲和层析对重组酶进行纯化，由SDS-PAGE 分析可知纯化后的重组酶TlLip2 的亚基分子量为57 ku，纯化倍数为12.3，TlLip2 的比酶活达到31 U／mg。

2）对该重组酶进行酶学性质测定，结果表明TlLip2 的最适温度为60 ℃，最适pH 为8.0，在60 ℃以下、pH 6.0～11.0 条件下稳定性较好。K+、Na+对TlLip2 有较大激活作用，相对酶活提高30%左右，Co2+、Zn2+、SDS 和Tween 80 对酶活力抑制作用明显，相对酶活降低超过70%。TlLip2 对中等碳链长度的脂肪酸显示出更高的活性，尤其是对硝基苯己酯。在大部分有机溶剂中有较好的耐受性，尤其是极性较低的有机溶剂，如正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷等。以对硝基苯棕榈酸酯为底物时，该酶的动力学常数Km为0.29 mmol／L，Vmax为2.28 mmol／（L·min-1），kcat为6.19 s-1。

3）TlLip2 催化制备油酸乙酯的反应体系中，油酸和乙醇的摩尔比为1 ∶2，加酶量为100 U／g （油酸），在60 ℃、180 r／min 下反应12 h，油酸乙酯的最高得率为62.1%，表明TlLip2 催化制备脂肪酸酯的效果较好，对长链脂肪酸酯的制备具有较好的应用前景。