红细胞洗涤对微柱凝胶卡检测直接抗人球蛋白试验影响的分析

吴伟鑫 魏俊杰 张云聪 黎绍昌 黄文庆 陈尚良

D A T是检测在体内已被不完全抗体或补体致敏的红细胞，常应用于自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、药物性溶血性贫血、新生儿溶血病以及输注不相合血液所致溶血性输血反应等检测[1，2]。以往DAT检测主要以试管法为主, 阳性率较低且结果不易判断, 而微柱凝胶技术具有操作简单且结果直观的特点[3]。微柱凝胶卡孔里注入颗粒介质，并在反应介质中预先加入抗人球蛋白抗体。由于颗粒介质具有分子筛作用，红细胞抗原与对应IgG抗体结合后，在抗人球蛋白抗体的搭桥作用下形成红细胞凝集团块。通过离心作用，未结合抗体的红细胞通过介质，到达底部，结果判为阴性；而发生抗原抗体反应出现凝集的红细胞被阻滞在介质上层或游离于介质中，结果判为阳性[4]。市面上的微柱凝胶卡检测DAT操作说明书大多未对患者标本红细胞是否洗涤进行明确规定，部分直接说明不需对患者标本红细胞进行洗涤，可配成一定浓度的红细胞悬液直接加规定的量到微柱凝胶卡里进行DAT。为探讨洗涤因素（次数及条件）是否对Gel检测DAT有影响，本研究通过对78例未进行洗涤RBC直接用Gel检测DAT阳性的标本，进行不同次数洗涤后检测DAT，结果发现Gel检测DAT与RBC洗涤，洗涤次数以及洗涤条件有关，现报导如下。

对象与方法

1 对象 将直接用Gel检测DAT阳性的78例标本纳入本研究；将研究组标本经洗涤后有变化（凝集强度为±～3＋）的71例标本纳入A组，洗涤后有变化（转为阴性）的4例标本纳入B组,洗涤后无变化的3例标本纳入C组。

2 仪器与试剂 抗-IgG和抗-C3d的抗球蛋白反应（Gel）卡(长春博迅公司)，抗球蛋白反应卡专用离心机(长春博迅公司)，移液器，移液器枪头，标本离心机，玻璃试管，生理盐水。

3 方法

3.1 未洗涤RBC的DAT：将待测的新鲜抗凝血标本压积红细胞用NS配成0.8%～1%浓度红细胞悬液待用。

3.2 经洗涤RBC的DAT：取待测的新鲜抗凝血标本压积红细胞经过NS三次充分洗涤后配成0.8%～1%浓度红细胞悬液待用。

3.3 将抗人球蛋白微柱凝胶卡撕去封条，做好相应标记，分别取3.1和3.2中配好的待测红细胞悬液、阴性对照红细胞悬液（未被IgG致敏的O细胞）、阳性对照红细胞悬液（被IgG致敏的O细胞）50 μL注入相应反应卡微柱管内，直接置于长春博迅公司配套离心机内离心5 min后观察结果。

3.4 将A、B组标本压积红细胞用NS进行洗涤，每洗涤一次后用生理盐水配制成0.8%～1.0%浓度的红细胞悬液并取50 μL加入相应做好标记的Gel里（总共洗涤五次）；同时各取阴性对照红细胞悬液（未被IgG致敏的O细胞）、阳性对照红细胞悬液（被IgG致敏的O细胞）50 μL加入相应标记的反应卡微柱管内，直接置于长春博迅公司配套的离心机内离心5 min后观察结果。

3.5 将C组标本压积红细胞用37℃的NS进行洗涤，每洗涤一次后用37℃的NS配制成0.8%～1.0%浓度的红细胞悬液并封口放入37℃水浴箱待用（总共洗涤五次）；将Gel撕去封条，做好相应洗涤次数标记（同时标记两组卡，一组卡未孵育15 min，一组卡孵育15 min），并分别取待用的红细胞悬液、阴性对照红细胞悬液（未被IgG致敏的O细胞）、阳性对照红细胞悬液（被IgG致敏的O细胞）50 μL加入相应标记的反应卡微柱管内，未孵育卡组直接置于长春博迅公司配套的离心机内离心5 min后观察结果，孵育卡组的卡放置于37℃孵育器里15 min后再离心5 min观察结果。

3.6 红细胞因抗原抗体反应而发生凝集时，它们不能透过微柱管反应腔内的凝胶介质而留在凝胶的上端或中上部，提示结果阳性；当红细胞完全沉于凝胶介质的底部时，提示结果为阴性，表明红细胞表面不存有任何抗体。DAT法阳性反应强度的判定：红细胞全部滞留在凝胶上层，下部凝胶背景清晰判为4+；红细胞大部分滞留在凝胶中上层，下部凝胶背景较清晰判为3+；大部分红细胞滞留在凝胶上层，下部凝胶背景略显红色判为2+；大部分红细胞沉积在微柱底部，少量红细胞滞留在凝胶介质中下层判为1+。为了标化DAT判读结果，特对试验结果的凝集强度进行相应打分，详见图1。

图1 DAT凝集强度相应打分

结 果

1 患者标本RBC未洗涤和洗涤后的DAT试验结果及其凝集强度分布如图2所示，从图2可以看出78例标本RBC经洗涤后的DAT阳性结果发生了变化：其中有4例转为阴性，原凝集强度为±的由14例变为4例，凝集强度为1+的由11例变为12例，凝集强度为2+的由23例变为16例，凝集强度为3+的由4例变为5例，凝集强度为4+的由26例变为34例。

图2 患者RBC未洗涤和洗涤后DAT结果

2 A组标本用室温NS洗涤不同次数后的DAT凝集强度变化如图3所示，从图3可以看出DAT的结果与RBC洗涤次数有一定的关系，第三次洗涤后的凝集强度最强，洗涤超过三次后凝集强度开始减弱。

3 B组标本用室温NS洗涤不同次数后的DAT凝集强度变化如图4所示，从图4可以看出患者标本RBC洗涤三次后DAT都转为阴性。

4 C组标本用37℃ NS洗涤不同次数后Gel未孵育与Gel孵育15 min后的DAT凝集强度变化如图5、图6所示，从图5可看出单纯用37℃NS洗涤但未Gel进行孵育的DAT结果并无明显变化；而将Gel孵育15 min后再离心的DAT结果在第四次洗涤孵育后转为阴性。

图3 A组标本的DAT结果

图4 B组标本的DAT结果

讨 论

目前市面上的直接抗人球蛋白试验微柱凝胶卡操作说明书并未对患者标本红细胞是否进行洗涤做出明确规定，而通过本研究可以看出：假如未对患者标本红细胞进行充分洗涤，可能会出现假阳性结果；而有些本来凝集强度挺强的实验结果会因为抗原抗体比例或者加入到微柱凝胶卡里的红细胞量不标准而导致微弱阳性甚至阴性从而导致漏检，对RBC进行洗涤及洗涤的次数、条件对DAT结果影响的原因如下。

图6 C组卡孵育15'的DAT结果

A组标本DAT结果的凝集强度有总体增强的趋势，凝集强度增强的幅度约为1+～1.5+，在第三次洗涤时凝集强度最强；经过洗涤凝集强度增强的可能原因为：①未经过洗涤时，可能由于实验室工作人员操作不规范导致吸到的红细胞混有部分血浆从而加入到微柱凝胶卡中的实际量达不到标准要求的量，进而由于抗原抗体比例问题导致凝集反应的强度没有洗涤后的强；②未经过洗涤时，假如实验室工作人员加样时吸到血浆，血浆中的蛋白会竞争部分微柱凝胶卡中的抗人球蛋白，从而导致凝集强度没有洗涤后的强[5]。

B组（洗涤后转为阴性的4例标本）的可能原因为：①患者因某些疾病的原因，在患者血清中含有过量的球蛋白或纤维蛋白，粘附在红细胞表面上使红细胞出现缗钱状聚集[6,7]，缗钱状的聚集红细胞比单个游离红细胞大，未能通过微柱凝胶卡的分子筛而在未洗涤前出现假阳性结果；②患者因某些疾病的原因，导致患者白细胞计数异常增高，而实验室操作人员加样技术不规范时吸到的红细胞混有大量的白细胞，而白细胞主要以中性粒细胞为主，其比单个游离的红细胞大，未能通过微柱凝胶卡的分子筛而在未洗涤前出现假阳性结果（这四例患者中两例为白细胞计数很高的白血病患者，一例为肝硬化患者，一例为MM患者）。

C组（洗涤前后无变化的3例标本）的可能原因是患者感染了支原体，导致患者体内会出现较高效价的冷凝集素，其能与自身红细胞反应，会干扰血型鉴定和DAT以及交叉配血试验，给输血带来困难[1，8，9]。此类患者的DAT标本必须经过37℃的生理盐水进行充分洗涤并将抗人球蛋白卡孵育后再离心判读结果，以免误判为阳性结果（患者的诊断都为肺炎或呼吸道感染）。

直接抗人球蛋白试验阳性的常见原因为：①自身抗体；②类同种特异性自身抗体；③同种特异性抗体；④药物抗体等[10，11]。直接抗人球蛋白试验阳性表明红细胞表面被不完全抗体或补体致敏，患者常常因红细胞破坏速度快于机体造血速度，或者新生红细胞同样被致敏破坏而存在一定程度的贫血,从而需要给该类患者输血治疗来纠正贫血。直抗阳性是提示患者贫血状态受免疫因素影响的重要指标[12]。

综上所述，Gel检测DAT应该对患者RBC进行三次洗涤，并结合患者的临床诊断以及标本的外观状态，选择相应的洗涤条件，以提高实验结果的准确性和可靠性，从而更好地指导临床用血，因为假阳性结果可能会导致临床申请输注洗涤红细胞悬液，而洗涤红细胞悬液需要花时间洗涤进而延误患者输血治疗；而把DAT微弱阳性结果归为阴性则会导致漏检从而不能规避可能因为同种抗体引起的输血反应[13，14]。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突