2个新的ABO血型等位基因的发现和序列分析

尹志柱 田丰 孙国栋 燕锋 董姗姗 高洁 高丽星

对2013年11月～2017年10月血清学方法鉴定为ABO亚型的95例标本进行基因直接测序分析时，发现2个新的ABO血型等位基因。现报道如下。

资料与方法

1 研究对象 新的ABO血型等位基因的4例标本。2例为健康的无偿献血者，互相之间无亲缘关系；2例为孕妇和其姐姐且均健康。

2 试剂与仪器 单克隆抗-A、抗-B，抗-H和A2细胞（均来自上海血液生物医药有限责任公司）；人ABO反定型用红细胞试剂（来自北京金豪制药股份有限公司）；人源抗-A、抗-B和抗-AB（本室自制）；台式离心机（KA-2200，日本久保田）；外周血基因组抽提试剂盒（BMS，Germany）；ABI3730测序仪。

3 血型血清学试验 按《全国临床检验操作规程》（第4版）的操作方法[1]进行试管法ABO血型正反定型及其他凝集试验和吸收放散试验，按血清学诊断标准来判断结果并做ABO亚型鉴定和分类[2]。

4 DNA制备 使用德国BMS公司DNA基因组抽提试剂盒抽提待检血液标本的基因组DNA。

5 PCR扩增及产物直接测序 委托天津秀鹏生物科技有限公司，采用PCR方法扩增ABO基因的7个外显子，对扩增产物进行DNA双链测序，对血清学为Bx和ABx的两例标本进行B等位基因第7外显子测序，对血清学为Ax的两例标本进行A等位基因第7外显子测序。

结 果

1 血型血清学试验 如表1所示，根据血型血清学试验反应格局，1号标本定型为Bx；2号标本定型为ABx；3号和4号标本红细胞经吸收放散试验可检出A抗原，定型为Ax。

2 PCR产物直接测序 2017年4月～2017年10月对待检标本的PCR产物进行直接测序分析，1号标本结果：一条链为ABO*O.01.01,一条链为ABO*B.01，并在此基础上发生c.449A＞G突变；2号标本结果：一条链为ABO*A1.02,一条链为ABO*B.01，并在此基础上发生c.449A＞G突变； 3号、4号标本结果：一条链为ABO*O.01.02,一条链为ABO*A1.02，并在此基础上发生c.798insT。2020年2月对1、2号标本ABO*B.01进行第7外显子测序证实c.449A＞G突变发生在ABO*B.01，对3、4号标本ABO*A1.02进行第7外显子测序证实c.798insT发生在ABO*A1.02。在国际输血学会（International Society of Blood Transfusion,ISBT）网站上红细胞免疫遗传学和血型术语命名[3]中检索A,B等位基因，发现c.449A＞G，c.467C＞T;c.798insT为 2个新核苷酸的改变，由此发现2个新的等位基因，见图1。

表1 4例标本的血型血清学反应格局

讨 论

Ax表型的主要血清学特征为：红细胞与抗-A不发生凝集，与抗-AB发生凝集，血清中通常含有抗-A1抗体，抗-A可以吸附在Ax细胞上并被洗脱[4]。本文的3号和4号标本经吸收放散试验证实，红细胞上存在弱的A抗原，其他血清学特征也符合Ax，因此，血清学方法确定为Ax表型。Bx和ABx红细胞可以与抗-B出现弱凝集，血清中可能存在抗-B[4]。本文的1号和2号标本血清学特征分别符合Bx和ABx，因此，血清学方法确定为Bx和ABx表型。

ABO血型基因位于第9条染色体(9q34.1～34.2),由大约19.5k个核苷酸组成，编码354个氨基酸，基因的核苷酸序列变异将可能直接改变抗原的氨基酸序列，也改变了抗原性[5]，产生不同的ABO亚型。ABO基因编码区有7个外显子，外显子6和7分别编码45个和230个氨基酸，是产生ABO亚型基因突变的主要区域[6]。ABO亚型是ABO的弱表现型，一般是由于基因突变形成的，且具有明确的血清学特点。

图1 新发现ABO血型等位基因的核苷酸突变

本研究中的4例ABO亚型标本，核苷酸的改变发生均在第7外显子，经单倍体测序，c.449A＞G突变发生在B等位基因，导致第150号氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸（Tyr150Cys），c.467C＞T;c.798insT突变发生在A等位基因，798位插入一个碱基T第266号氨基酸未发生突变，但是从第267号氨基酸开始发生移码突变（266fs+truncation），第289号氨基酸密码子变为终止密码子TGA，导致表达的肽链比正常A型肽链更短。基因突变影响了糖基转移酶的活性，从而影响了红细胞表面ABO抗原表达的数量，造成了血清学试验ABO抗原减弱的结果。c.449A＞G，c.467C＞T;c.798insT的位点突变情况在ISBT网站中未见报道，本文为首次报道。发生c.467C＞T;c.798insT的2例标本为亲姐妹，所以推测此2例标本的ABO亚型表型是通过遗传得到的，由于未能对其父母的ABO血型进行相关的检测所以无法证实其遗传性。

因此，结合ABO基因突变情况、血型血清学结果以及被检测者已知身体健康情况，我们认为此4例标本ABO血型抗原的减弱改变与ABO基因位点变异存在直接关系。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突