香桂精油的微波辅助提取、化学成分和抗菌活性研究

杨婷，邓楠，旷春桃

(中南林业科技大学 材料科学与工程学院，长沙 410004)

香桂是樟科樟属植物，主要产于我国湖南、云南、贵州等地区。鲜叶中挥发油含量高达3%～4%，茎枝、干叶、根茎和果实中挥发油含量比鲜叶中低[1]。香桂精油具有特殊香味[2]，可直接用于饮料和食品工业中，如用作增香剂和防腐剂[3]。香桂精油主要成分为黄樟油素、蒎烯、芳樟醇、樟脑、丁香酚等[4]，其中黄樟油素含量大于90%，是合成洋茉莉醛、新洋茉莉醛和香兰素等香料的重要原料[5]。因此，香桂精油的提取、化学成分分析及其抗菌活性对于香桂资源的利用具有重要价值。

目前，植物精油的提取常采用水蒸气蒸馏法(SD)、溶剂浸提法、超临界CO2流体萃取法、微波辅助提取法(MASD)、超声-微波辅助提取法(UMASD)等方法[6-9]。MASD是将传统的溶剂萃取法与微波相结合，高频电磁波穿透萃取介质，微波能使细胞内部的温度迅速上升，导致植物原料细胞破裂，降低了提取物溶出的传质阻力，提高了提取效率[10]。因此，MASD具有提取效率高、操作简单、时间短、穿透力强等优点[11]，已成为植物精油提取的重要方法。

本研究以香桂叶为原料，采用MASD提取香桂精油，考察了液料比、提取时间、微波功率对香桂精油得率的影响，优化其提取工艺，同时利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测香桂精油的化学成分，并对香桂精油的抑菌活性进行研究，旨在为香桂的综合利用提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

香桂叶：湖南湘西，剪碎，备用；酵母提取物、胰蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；青霉素钠试剂：哈药集团制药总厂；葡萄糖：天津致远化学试剂有限公司；马铃薯：购于长沙市铁道学院农贸市场；其他试剂均为分析纯。

供试菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger)，均由本校微生物实验室提供。

1.2 培养基

1.2.1 LB培养基

酵母提取物5 g，氯化钠 10 g，胰蛋白胨10 g，固体培养基加琼脂15～20 g，加水定容至1 L。121 ℃灭菌30 min，待用。

1.2.2 PDA培养基

将200 g马铃薯切块煮沸过滤得马铃薯汁，加葡萄糖20 g，固体培养基加琼脂15～20 g，加水定容至1 L。121 ℃灭菌30 min，待用。

1.3 仪器与设备

CW 2000超声-微波协同萃取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司；HPX-9052MBE恒温振荡培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；CA-920-3超净操作台 上海净化制备厂；Clarcus 600气相色谱-质谱联用仪 Perkin Elmer公司。

1.4 试验方法

1.4.1 MASD提取香桂精油

采用课题组组装的MASD提取装置提取香桂精油，其装置图见图1。

图1 MASD提取香桂精油的装置图Fig.1 Device for extracting Cinnamomum subavenium essential oil by MASD

图1中将一定量的香桂叶和蒸馏水一起加入超声-微波协同萃取仪中，设定提取时间和微波功率进行香桂精油的微波提取，然后将得到的提取液静置分层，收集精油，计算香桂精油的得率，得率按下式计算：

1.4.2 GC-MS分析

气相色谱条件：色谱柱：Elite-5MS(30m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为He；进样口温度250 ℃；程序升温：初始温度75 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的升温速率升至140 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的升温速率升至240 ℃；进样量0.5 μL；分流比60∶1；稀释比20∶1。

质谱条件：离子源EI源；电子能量70 eV；离子源温度240 ℃；扫描范围35～500 m/z。

1.4.3 抑菌活性测试

细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)在LB培养基中培养8～10 h，真菌(根霉、黑曲霉)在PDA培养基中培养12～16 h。使用无菌水稀释并制备成浓度为106～107CFU/mL的均匀菌液。采用二倍稀释法，用灭菌处理的DMSO制备成不同浓度的香桂精油样品溶液。

采用滤纸片法测定香桂精油的抑菌圈[12]，倒入20～25 mL的LB、PDA培养基于无菌培养皿中，凝固后，分别吸取200 μL 4种菌悬液均匀涂布于相应的培养基表面。将灭菌后直径为5.5 mm的滤纸片贴在含菌平板上，滴加5.0 μL不同浓度的香桂精油样品溶液，以青霉素钠作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。在34 ℃条件下细菌培养24 h，在32 ℃条件下真菌培养48 h。通过测量抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)，评价香桂精油的抑菌活性，每个浓度做两组平行试验。

2 结果与讨论

2.1 不同条件对香桂精油得率的影响

2.1.1 液料比的影响

设定微波功率为100 W，提取时间为2 h，按液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)的条件分别提取香桂精油，结果见图2。

由图2可知，当液料比为20∶1(mL/g)时，香桂精油得率最大，为4.30%。液料比较小时，蒸馏水浸泡香桂不够充分，香桂精油得率小，但是蒸馏水用量太大，会吸收更多的微波能，使香桂叶吸收微波能下降，导致微波破坏植物细胞的能力下降，香桂精油得率降低[13]。因此，20∶1(mL/g)为最佳液料比。

图2 液料比对香桂精油得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on yield of Cinnamomum subavenium essential oil

2.1.2 微波功率的影响

设定液料比为20∶1(mL/g)，提取时间为2 h，分别在微波功率为60，70，80，90，100 W的条件下提取香桂精油，结果见图3。

图3 微波功率对香桂精油得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on yield of Cinnamomum subavenium essential oil

由图3可知，当微波功率为100 W时，香桂精油得率达到最高。随着微波功率的提高，体系的升温速率加快，细胞壁迅速破裂，香桂精油大量进入萃取介质[14]。但是，微波功率太高，加热速度过快，会使原料焦糊，有效成分可能高温分解，香桂精油得率下降[15]。因此，100 W为微波最佳功率。

2.1.3 提取时间的影响

设定液料比为20∶1(mL/g)，微波功率为100 W，分别在提取时间为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h的条件下提取香桂精油，结果见图4。

图4 提取时间对香桂精油得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on yield of Cinnamomum subavenium essential oil

由图4可知，当提取时间为1.5 h时，提取率达到4.43%，之后继续延长提取时间，香桂精油得率稍有下降。这是因为在一定时间内，提取时间增加，物料会吸收更多的微波能，使植物细胞充分破裂，香桂精油溶出更多，所以得率上升[16]。但提取时间过长，有效成分挥发，使香桂精油得率下降。故适宜的提取时间为1.5 h。

2.2 SD和MASD提取香桂精油的工艺比较

采用SD提取香桂叶中香桂精油，优化其提取工艺，SD和MASD提取香桂精油的优化工艺条件见表1。

表1 SD和MASD提取香桂精油的优化工艺条件Table 1 Optimized process conditions of Cinnamomum subavenium essential oil extracted by SD and MASD

由表1可知，MASD提取时间为1.5 h，香桂精油得率为4.43%，比SD提高0.14%，提取时间减少，提取效率增加。

2.3 香桂精油的化学成分分析

香桂精油的GC-MS分析结果见表2。

表2 香桂精油的化学成分Table 2 Chemical constituents of Cinnamomum subavenium essential oil

续 表

经与Nist标准谱库对照，初步分析鉴定出香桂精油中13 种成分，占色谱总流出峰面积的99.96%，相对含量最高的化合物是黄樟油素，为98.408%。还有少量的α-蒎烯、柠檬烯、沉香醇、丁子香酚、α-广藿香等化合物。

2.4 抑菌性能分析

香桂精油对4种供试菌的最小抑菌浓度(MIC)见表3。

表3 香桂精油对4种菌株的最小抑菌浓度MICTable 3 MIC of Cinnamomum subavenium essential oil to four strains

注：“+”表示MIC小于 0.78 mg/mL，“-”表示无明显抑菌圈。

结果表明，香桂精油对4种供试菌均有一定的抑菌效果，其中对根霉的抑菌活性优于对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉的抑菌活性。同时，香桂精油对真菌的抑制作用优于细菌。此外，香桂精油对这4种菌的抑制作用均不如青霉素钠阳性对照组。

3 结论

本研究采用MASD从香桂叶中提取香桂精油，以香桂精油的得率为指标，通过单因素试验优化了其提取工艺。结果表明：在液料比为20∶1(mL/g)，微波功率为100 W，提取时间为1.5 h的条件下，香桂精油得率为4.43%。与SD比较，得率提高了0.14%，并大大缩短了提取时间。采用GC-MS对香桂精油的化学成分进行了分析，鉴定出 13 种成分，其中黄樟油素含量为98.408%。香桂精油对4种供试菌均具有一定的抑制作用，其中对根霉抑制作用最强，MIC为6.25 mg/mL。