甜柿果醋发酵工艺优化及抗氧化研究

李巧凤，熊汉国*，熊舟翼

(1.华中农业大学 食品科学与技术学院，武汉 430070；2.武汉农业科学技术研究院 农产品加工中心，武汉 430200)

甜柿(non-astringent persimmon)属柿科柿属，是一种多年生落叶果树，已有近千年的栽培历史，主要分布于大别山区[1]。甜柿鲜艳多汁，含有大量的葡萄糖、果糖、多种氨基酸及矿物质等，具有较高的食用价值，被誉为“果中圣品”[2]。此外，甜柿含有丰富的维生素C和多酚类物质，具有抗氧化和预防心血管疾病的作用[3]。罗田县的甜柿因分布面积广、种类多、种植历史久，被称为 “罗田甜柿”[4]。罗田甜柿，是我国唯一原产的甜柿品种，含糖量高，同时籽粒少，便于加工，是酿造果醋的优质原料。然而，甜柿属于易腐烂的呼吸性果实，在采摘、运输过程中会造成大量残次果，这些残次果可用于酿造果醋，避免经济损失，所以开发甜柿果醋具有广泛的应用前景和可观的经济价值。

果醋是以水果及其下脚料为原料，经酒精发酵和醋酸发酵加工而成的新型酸性饮品或调味品[5]。与粮食醋相比，果醋不仅有食醋的营养保健功能，还保留了水果原有的营养成分和其特殊的芳香物质[6]。碎米中含有大量的淀粉，可利用根霉菌产生的淀粉酶，将淀粉转化为可发酵性糖，控制其发酵时间得到高糖低醇的甜碎米酒[7]。利用碎米产糖发酵得到的高糖碎米酒作为甜柿果醋发酵的调糖剂，提高发酵底物的糖度，将其加工成果醋，不仅可以得到风味独特、口感丰富的特色果醋，还能提高甜柿的附加值和碎米的利用率。本研究以罗田甜柿为原料，利用单因素和响应面优化果醋的酒精发酵和醋酸发酵阶段，从而确定甜柿果醋的发酵参数，并对其抗氧化能力进行研究，为甜柿果醋的加工和应用提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜柿：购于湖北罗田县；碎米：购于湖北国诚米业粮食饲料加工厂；葡萄酒高活性干酵母：安琪酵母有限公司；沪酿1.01醋酸菌：北京食品酿造研究所；果胶酶(500 U/mg)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、2,2′-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)：上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、无水乙醇、氢氧化钠：均为国产分析纯。

1.2 设备与仪器

WTF手持式糖度仪、恒温培养箱 上海索谱仪器有限公司； 恒温摇床培养箱 江苏金坛市医疗仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；pH计 上海智光仪器仪表有限公司；0-40型酒精计 浙江余姚市黄家埠玻璃仪表厂；UV-1700可见分光光度计 日本岛津公司；榨汁机 合肥荣事达股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甜柿果醋的加工工艺

1.3.2 操作要点

甜柿果浆的制备：挑选成熟、无病害的甜柿，洗净后去蒂、去核切成小块，用榨汁机打浆。然后向果浆中加入0.03%果胶酶，于50 ℃水浴酶解2 h，分解果胶，提高出汁率。

碎米酒的制备：将碎米蒸熟、摊凉后，加入甜酒曲，发酵3 d，然后用纱布过滤，得到高糖低醇的甜碎米酒(糖度约为23 °Bx，酒精度约为1%)。

糖度调整：将处理好的甜柿果浆、碎米酒和蒸馏水按照一定比例混合，通过评价确定混合比例，加入白砂糖调节初始糖度为16 °Bx。

酒精发酵：在甜柿果浆中接种酵母菌，按试验设计将其放置在恒温培养箱中进行酒精发酵。

醋酸发酵：酒精发酵结束后，将发酵液进行粗滤，得到甜柿果酒，接入活化扩大培养后的醋酸菌，按试验设计将果酒放置在恒温摇床中进行醋酸发酵。

1.3.3 酒精发酵条件优化

试验选取甜柿果浆、甜米酒和水体积混合比(1∶0∶1、1∶1∶0、1∶1∶1、1∶0∶2、1∶2∶0)、发酵时间(0，1，2，3，4，5，6 d)、发酵温度(22，25，28，31，34 ℃)、酵母接种量(0.02%、0.06%、0.10%、0.14%、0.18%)进行单因素试验，以发酵液的酒精度为指标，确定甜柿果酒的最佳发酵参数。

1.3.4 醋酸发酵条件优化

在预试验基础上，以发酵方式、初始酒精度(5%、6%、7%、8%、9%)、发酵温度(24，27，30，33，36 ℃)、醋酸菌接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、初始pH值(3，4，5，6，7)为影响因素进行单因素试验。在单因素试验的基础上，设计四因素三水平的响应面分析试验，以总酸含量为评价指标，采用Box-Benhnken响应面试验设计，确定醋酸发酵的最佳工艺参数，试验因素水平表见表1。

表1 Box-Benhnken试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiment

1.3.5 指标测定

糖度：使用手持糖度计测定；酒精度：采用蒸馏法测定；总酸含量：用0.1 mol/L NaOH溶液进行酸碱滴定(以醋酸计)；DPPH·自由基清除率：参照王志煌[8]的方法测定；ABST+·自由基清除率：参照李华等[9]的方法测定。

2 结果与分析

2.1 酒精发酵单因素试验

2.1.1 甜柿果浆、碎米酒和水混合比例的确定

表2 甜柿果浆、甜米酒和水的混合配比对果酒的影响Table 2 Effect of the ratio of non-astringent persimmon pulp, broken rice wine and water on fruit wine

由表2可知，甜柿果浆、碎米酒与水的体积比为1∶1∶1时酿造得到的果酒感官评价最高，甜柿果酒的口感和芳香特征均符合感官要求，糖度利用率高。但单独添加碎米酒，会造成米酒味过重，口感较差，同时会导致酒精度过高，造成资源浪费。因此，试验选择甜柿果浆、碎米酒与水的最佳配比为1∶1∶1。

2.1.2 发酵时间对酒精发酵的影响

图1 发酵时间对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of fermentation time on alcohol fermentation

由图1可知，随着发酵时间的延长，发酵液的糖度先快速降低后趋于稳定，而酒精度的变化趋势与糖度相反。这是由于发酵前期酵母菌生长旺盛，大量的还原糖被酵母利用转化为酒精[10]。在第4天时酒精发酵基本停止，糖度和酒精度稳定不变。因此，选择酒精发酵的最适发酵时间为4 d。

2.1.3 发酵温度对酒精发酵的影响

由图2可知，当发酵温度较低时，酒精度随着发酵温度的升高而增大。当发酵温度为28 ℃时，得到的酒精度最高且发酵结束后甜柿果酒中的残糖量最低。酵母菌生长有一个最适温度，当发酵温度过低时，酵母菌的生长繁殖和代谢缓慢，导致发酵周期长，产酒率低，而温度过高会导致酵母代谢异常，发酵后残糖量高，发酵不完全[11]。因此，甜柿果酒发酵的最适温度为28 ℃。

图2 发酵温度对酒精发酵的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation

2.1.4 酵母接种量对酒精发酵的影响

图3 酵母接种量对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of yeast inoculation amount on alcohol fermentation

在酒精发酵过程中，酵母接种量越大，其产酒精速率越高，周期越短。由图3可知，酵母接种量为0.1%时，甜柿果酒的酒精度最高，为8.5%，且残糖量低。但当酵母接种量超过0.1%时，酒精度随着酵母接种量的增加而下降，这是由于酵母大量繁殖，代谢旺盛，消耗了部分底物，导致酒精度下降，且会产生过多的代谢废物，影响产品风味[12]。因此，选择甜柿果酒发酵的最适接种量为0.1%。

2.2 醋酸发酵单因素试验

2.2.1 发酵方式

图4 发酵方式对醋酸发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation modes on aceticacid fermentation

醋酸菌是好氧菌，发酵液中的溶氧量与醋酸菌的生长代谢密切相关[13]。由图4可知，发酵前期，静止发酵与摇床发酵相差不大，因为醋酸菌处于生长期，需氧量相对较少。但在发酵第6天后，静止发酵液的酸度缓慢上升，而摇床发酵液的酸度快速增加。第12天后，摇床醋酸发酵已基本完成，酸度不再增加。这是由于摇床能增加发酵液中的溶氧量，为醋酸菌代谢提供充足的氧气，缩短发酵周期[14]。因此，选择摇床发酵方式为宜。

2.2.2 初始酒精度

图5 初始酒精度对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation

酒精是醋酸菌生长代谢所需的营养物质，也是醋酸发酵的主要底物。由图5可知，初始酒精度为5%～7%时，总酸随着初始酒精度的增加而增加。但当酒精含量超过8%时，醋酸菌产酸速率降低，总酸含量也显著减少。这是因为较高的酒精度会抑制醋酸菌的生长繁殖，降低其活力，延长发酵周期。因此，选择初始酒精度为7%左右较为合适。

2.2.3 醋酸菌接种量

图6 醋酸菌接种量对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on acetic acid fermentation

由图6可知，不同的醋酸菌接种量，甜柿果醋中总酸含量也不同。适当增加醋酸菌接种量可以提高产酸率，缩短发酵周期。接种量为6%的发酵液，总酸含量最高且产酸率快。但当接种量大于6%时，产酸量降低，这是由于接种量过大，醋酸菌生长繁殖消耗过多的营养物质，同时会出现菌体过早老化，影响发酵效果。因此，选择醋酸菌接种量为6%左右较为合适。

2.2.4 发酵温度

图7 发酵温度对醋酸发酵的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

由图7可知，在24～30 ℃，随着发酵温度升高，醋酸菌的产酸量上升。当温度为30 ℃时，甜柿果醋的总酸含量最高，为4.36 g/dL。但温度过高时，总酸含量下降，这是由于醋酸菌生长代谢旺盛，提前老化且高温下部分成分挥发加快，使产酸率降低[15]。因此，选择发酵温度为30 ℃左右较为合适。

2.2.5 初始pH值

图8 初始pH值对醋酸发酵的影响Fig.8 Effect of initial pH value on acetic acid fermentation

发酵液的pH会影响醋酸菌的生长代谢和产酸速率。由图8可知，当初始pH在5左右时，醋酸菌代谢旺盛，产酸率高，发酵液中总酸含量高。但当pH值过低或过高时，都会抑制醋酸菌生长，导致总酸含量降低，同时也会影响果醋的品质[16]。因此，选择醋酸发酵的初始pH为5左右较为合适。

2.3 醋酸发酵的响应面优化试验

根据单因素试验结果，进行四因素三水平的响应面优化试验，以总酸含量为响应指标，试验结果见表3。使用Design-Expert软件对试验结果进行回归分析，回归模型的方差分析见表4。

表4 响应面试验方差分析结果Table 4 Results of variance analysis of response surface experiment

续 表

注：“*”表示差异性显著(P<0.05)；“**”表示差异性极显著(P<0.01)。

由表4可知，回归方程模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，且相关性系数R2=0.96，说明该模型的试验拟合度高，试验误差小，能够对醋酸发酵工艺条件进行较好的分析和预测。由表4方差分析可知，模型的一次项初始酒精度A的影响极显著(P<0.01)，醋酸菌接种量B、发酵温度C的影响显著(P<0.05)，二次项A2、B2、C2、D2的影响极显著(P<0.01)，表明这3个因素对醋酸发酵的影响较大，而初始pH值对醋酸发酵的影响不显著。交互项AD、BC的影响极显著，其他交互项的影响均不显著。

通过对回归模型的分析得到最佳醋酸发酵工艺条件为：初始酒精度7.25%、醋酸菌接种量5.89%、发酵温度29.78 ℃、初始pH值5，此工艺条件下得到的总酸预测值为5.28 g/dL。考虑到试验的可行性，将工艺参数调整为：初始酒精度7%、醋酸菌接种量6%、发酵温度30 ℃、初始pH值5。经3次重复试验后，得到的实际总酸均值为5.31 g/dL，与预测值偏差较小，表明模型能很好地预测试验结果，具有一定的参考价值。

2.4 甜柿果醋的抗氧化能力

图9 不同样品对DPPH·和ABTS+·自由基的清除能力Fig.9 The scavenging capacity of different samples to DPPH·and ABTS+· free radicals

甜柿果醋营养丰富，含有大量的活性成分，如多酚类物质，具有一定的抗氧化能力[17]。将同浓度的甜柿果醋与市售的某品牌柿子醋及维生素C进行清除DPPH·和ABTS+·自由基能力的比较。由图9可知，当甜柿果醋在体积分数为20%时，DPPH·自由基清除率约为75%，ABTS+·自由基清除率约为63%，同比，维生素C在2 μg/mL时清除率分别约为30%、10%，表明甜柿果醋具有较强的抗氧化能力。甜柿果醋的DPPH·和ABTS+·自由基清除能力略高于市售的柿子醋，可能是由于柿子品种不同或发酵工艺不同，导致不同柿子醋的抗氧化能力有一定的差异。

3 结论

本文以甜柿为原料，添加高糖低醇碎米甜酒，对果醋的发酵工艺进行优化并对其抗氧化能力进行分析。酒精发酵的最适工艺参数为甜柿果浆、甜米酒和水配比1∶1∶1，发酵4 d，发酵温度28 ℃，酵母接种量0.1%。醋酸发酵的最佳发酵工艺参数为初始酒精度7%，发酵温度30 ℃，醋酸菌接种量6%和初始pH值5。在此条件下，发酵12 d后的甜柿果醋总酸含量可以达到5.31 g/dL，同时甜柿果醋表现出良好的体外抗氧化能力。本研究开发了甜柿果醋生产新工艺，提高了甜柿和碎米的经济效益。