酶解时间对牡蛎酶解液挥发性风味成分的影响

杨昭，姚玉静，黄佳佳，梁瑞进，梁健平，何惠

(广东食品药品职业学院 食品学院，广州 510520)

牡蛎富含蛋白质，营养价值高，被称为“海洋牛奶”，是世界第一大养殖贝类[1]。采用蛋白酶对牡蛎进行酶解，是制备牡蛎呈味基料的重要方法[2]。由于牡蛎酶解液中富含功能肽和游离氨基酸，被认为是极具应用前景的高品质呈味基料[3]。呈味基料具有强烈的鲜味和特征性风味，对高值调味品和调味酱的研制有重要作用[4]，呈味基料的风味对其应用有重要影响。现有大量研究者关注牡蛎酶解前后挥发性风味物质的变化。刘晓丽等[5]采用SPME-GC-MS从中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牡蛎的酶解液中分别鉴定出62种和60种成分，主要有烃类、醇类、醛类、酮类和含硫化合物等。邓嫣容[6]采用气相色谱-质谱法对复合蛋白酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶)酶解牡蛎的酶解液风味成分进行分析，鉴定出20种化合物。张梅超[7]研究发现牡蛎酶解后腥味、苦涩味和哈喇味加重，青草味减少。苏明月等[8]采用SPME-GC-MS对碱性蛋白酶酶解牡蛎过程中的挥发性风味成分进行分析，在0，1，3 h从牡蛎酶解液中分别鉴定出31，32，36种挥发性风味物质。前期研究发现，胰蛋白酶和风味蛋白酶组成的复合酶是制备牡蛎呈味基料较佳的蛋白酶组合。但随着酶解时间的增加，牡蛎酶解液的感官评分却呈现先缓慢升高再缓慢降低的趋势[9]。牡蛎酶解过程中脂质氧化降解和蛋白质降解，会对牡蛎酶解液的风味造成影响[10]。因此，为探究复合蛋白酶酶解时间对牡蛎酶解液挥发性风味物质的影响，采用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)联用法分析0.5，1，4，8 h牡蛎酶解液的挥发性成分，为牡蛎呈味基料的工业化应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

近江牡蛎肉：购于广州黄沙水产市场；胰蛋白酶：重庆市全新祥盛生物制药有限公司；风味蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司；氢氧化钠、盐酸：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪 日本岛津制作所；FE22-Standard pH计 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；DKZ-3B电热恒温振荡水槽 上海一恒科学仪器有限公司；3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；50 μm二乙苯基/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取头、手动SPME进样手柄 美国Supelco 公司。

1.3 牡蛎酶解液制备

冻藏牡蛎肉置于室温溶解后，准确称取100 g，加入100 g蒸馏水，打浆后调整pH值至7.0，加入浆液总重量0.2%的胰蛋白酶和0.1%的风味蛋白酶，搅拌均匀后倒入1 L的烧杯中，在55 ℃水浴摇床中分别酶解0.5，1，4，8 h。酶解结束后，将盛有酶解液的烧杯置于水浴锅中于95 ℃灭酶20 min。酶解液室温冷却后，在4 ℃条件下以8000 r/min离心10 min，取上清液即为牡蛎酶解液，-18 ℃冻存备用[11]。

1.4 挥发性风味成分分析

1.4.1 挥发性风味成分提取

称取3 g牡蛎酶解液，装入顶空萃取瓶中，置于55 ℃下平衡10 min后，将DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中，吸附1 h后拔出萃取头，用于GC-MS检测。

1.4.2 挥发性风味成分鉴定

色谱条件：Rts-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。不分流进样，载气为高纯氦气(99.999%)，流速为0.8 mL/min。升温程序：柱初温35 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至100 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。进样口温度为230 ℃，解吸温度为230 ℃，解吸时间为5 min。

质谱条件：离子化方式EI；电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，质量扫描范围35～500 m/z。

1.4.3 挥发性风味成分图谱分析

通过NIST 11谱库对各色谱峰进行检索，取相似度大于80%的物质，并结合文献报道对物质进行定性，确定挥发性风味成分。仅统计相对含量≥0.1%的化合物，以面积归一化法确定各挥发性风味成分的相对含量[12]。

2 结果与分析

2.1 SPME-GC-MS总离子流色谱图

酶解时间为0.5，1，4，8 h牡蛎酶解液的挥发性风味成分总离子流色谱图见图1～图4。

图1 0.5 h牡蛎酶解液挥发性风味成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 0.5 h

图2 1 h牡蛎酶解液挥发性风味成分总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 1 h

图3 4 h牡蛎酶解液挥发性风味成分总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 4 h

图4 8 h牡蛎酶解液挥发性风味成分总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 8 h

由图1～图4可知，4种牡蛎酶解液挥发性风味成分的总离子流色谱图分离度较好，挥发性成分出峰时间主要在10～20 min和30～40 min之间。牡蛎酶解液挥发性风味成分通过SPME萃取，经GC-MS分析，保留匹配度≥80的化合物，在4种牡蛎酶解液中共鉴定出89种化合物。0.5，1，4，8 h牡蛎酶解液分别鉴定出51，52，60，51种化合物。

2.2 不同酶解时间牡蛎酶解液挥发性风味成分比较

表1 牡蛎酶解液挥发性风味成分种类和相对含量Table 1 The types and relative content of volatile flavor components in oyster hydrolysate

续 表

续 表

续 表

注“—”表示未检测出。

表2 牡蛎酶解液挥发性风味成分中各类化合物的数量和相对含量Table 2 The quantity and relative content of volatile flavor components in oyster hydrolysate

由表1和表2可知，0.5 h牡蛎酶解液鉴定出51种化合物，主要含有10种醇类(20.59%)、15种醛类(22.89%)、6种酯类(5.41%)、4种酮类(1.33%)、11种烃类(16.61%)和5种杂环和其他类(1.54%)。1 h牡蛎酶解液鉴定出52种化合物，主要含有9种醇类(15.91%)、16种醛类(16.13%)、6种酯类(5.57%)、4种酮类(0.77%)、9种烃类(16.04%)和8种杂环和其他类(2.22%)。4 h牡蛎酶解液鉴定出60种化合物，主要含有10种醇类(23.08%)、16种醛类(9.99%)、5种酯类(5.71%)、5种酮类(1.69%)、15种烃类(22.58%)和9种杂环和其他类(2.51%)。8 h牡蛎酶解液鉴定出51种化合物，主要含有9种醇类(14.73%)、14种醛类(8.81%)、5种酯类(3.18%)、4种酮类(8.9%)、13种烃类(25.4%)、6种杂环和其他类(3.18%)。

4种牡蛎酶解液中均含有的挥发性风味成分有24种，包含4种醇类、10种醛类、1种酯类、4种酮类、2种烃类、3种杂环和其他类。2-壬酮、3,6-壬二烯醛、三氯乙酸壬酯、十三醛和正壬基环己烷为0.5 h牡蛎酶解液中独有的挥发性风味成分。氯甲酸正壬基酯、2-溴十二烷、2-十二烯-1-醇为1 h牡蛎酶解液中独有的挥发性风味成分。2-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮、2-甲基戊酸酸酐、环己烷-1,4-二甲醇二乙酸酯、1,1-二甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-环丙烷、2-丁基-1-辛醇、4-(1,2-二甲基环戊-2-烯基)-丁烷-2-酮、2,6,10,14-四甲基十五烷、苊、十六烯和2,4-二叔丁基苯酚为4 h牡蛎酶解液中独有的挥发性风味成分。1-(2-甲氧基丙氧基)-2-丙醇、亚麻酸、庚基环己烷和亚麻醇为8 h牡蛎酶解液中独有的挥发性风味成分。

醇类、醛类、酯类和酮类的风味阈值相对较低，对于风味的影响较大。为剖析酶解时间对牡蛎酶解液挥发性风味成分的影响，对4种牡蛎酶解液的挥发性风味成分进行了分析和比较。

醇类物质通常是由脂肪酸氧化酶作用于多不饱和脂肪酸衍生而来。饱和醇类化合物由于阈值较大，一般对牡蛎气味贡献不大。但有些含量特别高或是不饱和的烯醇式结构化合物阈值较低，可能会对牡蛎风味有较大贡献。醇类物质通常具有植物香甜味、柔和的芳香、酸败和土气味。1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇是亚油酸酯或亚麻酸酯氢过氧化合物的降解产物，在海南岛养殖近江牡蛎中被鉴定出，被认为是牡蛎特有的类似蘑菇香气的主要成分[13]。由表1可知，1-辛烯-3-醇在4种牡蛎酶解液中均存在，且是醇类物质中含量最高的，其在0.5，1，4，8 h牡蛎酶解液中含量分别为7.74%、7.23%、10.04%和9.86%。2-辛烯-1-醇在0.5，1，4 h牡蛎酶解液中含量分别为2.1%、1.63%和2.01%，而其在8 h牡蛎酶解液中未被检测到。

醛类物质是脂肪氧化的主要产物，阈值相对较低，对水产品的风味有较大的贡献[14]。目前已确认水产品的鱼腥味物质为一些醛类和烯醛类，主要包括以下几种化合物：正己醛、正庚醛、2,4-二烯癸醛、2,4,7-三烯癸醛、二烯庚醛、二烯癸醛和4-烯庚醛等[15]。4-庚烯醛具有鱼腥味、青草、油脂香气。2-辛烯醛具有油脂味、坚果味。2,6-壬二烯醛具有黄瓜味。3,6-壬二烯醛具有青味。2-壬烯醛具有肉香、蘑菇、青味。癸醛具有海味。辛醛具有脂味、蘑菇味。由表1可知，4-庚烯醛和2,6-壬二烯醛在4种牡蛎酶解液中均存在，且是醛类物质中含量最高的。4-庚烯醛在0.5，1，4，8 h牡蛎酶解液中含量分别为4.59%、3.87%、2.38%和2.04%。2,6-壬二烯醛在0.5，1，4，8 h牡蛎酶解液中含量分别为12.22%、7.08%、1.76%和0.22%。随着酶解时间的增加，4-庚烯醛和2,6-壬二烯醛相对含量明显减少。

酯类化合物是醇和酸通过酯化作用缩合而成，阈值较低，一般具有显著的香味特征[16]。4种牡蛎酶解液的酯类挥发性成分种类存在较大的差异。3-己烯醇甲酸酯和酞酸二乙酯在牡蛎酶解液中含量较高。 3-己烯醇甲酸酯在0.5 h和1 h牡蛎酶解液中含量分别为1.63%和1.54%，而其在4 h和8 h牡蛎酶解液中未被检测到。酞酸二乙酯在0.5，1，4 h牡蛎酶解液中含量分别为2.89%、3.25%和3.63%，而其在8 h牡蛎酶解液中未被检测到。

酮类化合物可能是氨基酸分解、多不饱和脂肪热氧化和降解或微生物氧化产生，其阈值一般比较高。酮类贡献出牡蛎甜的花香、果香等气味。4种牡蛎酶解液的酮类挥发性成分种类有较大的差异，且含量均较低。苯乙酮在4种牡蛎酶解液中均存在，但在8 h牡蛎酶解液中含量最高，为6.55%。2-甲基环辛烷-1-酮在8 h牡蛎酶解液中含量也较高，相对含量为1.67%。

3 结论

4种牡蛎酶解液中共鉴定出89种化合物。0.5 h牡蛎酶解液鉴定出51种化合物，主要含有10种醇类(20.59%)、15种醛类(22.89%)、6种酯类(5.41%)、4种酮类(1.33%)、11种烃类(16.61%)和5种杂环和其他类(1.54%)。1 h牡蛎酶解液鉴定出52种化合物，主要含有9种醇类(15.91%)、16种醛类(16.13%)、6种酯类(5.57%)、4种酮类(0.77%)、9种烃类(16.04%)和8种杂环和其他类(2.22%)。4 h牡蛎酶解液鉴定出60种化合物，主要含有10种醇类(23.08%)、16种醛类(9.99%)、5种酯类(5.71%)、5种酮类(1.69%)、15种烃类(22.58%)和9种杂环和其他类(2.51%)。8 h牡蛎酶解液鉴定出51种化合物，主要含有9种醇类(14.73%)、14种醛类(8.81%)、5种酯类(3.18%)、4种酮类(8.9%)、13种烃类(25.4%)、6种杂环和其他类(3.18%)。4种牡蛎酶解液中均含有的挥发性风味成分有24种，包含4种醇类、10种醛类、1种酯类、4种酮类、2种烃类、3种杂环和其他类化合物。