超声波协同微波处理对枣汁营养成分和抗氧化活性的影响

程晓雯，于有伟，张晨星，张少颖，徐建国，崔美林

（山西师范大学食品科学学院，山西临汾 041004）

红枣具有丰富的营养成分和药用价值[1]。与普通水果相比，虽然含水量少，但含有丰富的多糖、黄酮、多酚、维生素C 以及环核苷酸类等生物活性成分[2]，这些成分的存在使红枣的抗氧化活性增强[3]。红枣具有保健功效，可以抗癌、养肝护肝、养血补血等，被称为“营养保健丸”[4]。多糖、维生素C、多酚和黄酮类物质参与体内氧化还原过程，可增强机体解毒功能[5]。环磷酸腺苷物质则可防治心血管病[6]。这些物质参与机体内的各种反应，可清除体内自由基，延缓人体衰老。在红枣汁提取过程中，品种、加工方式都可能造成枣果中营养组分的损失。

超声和微波处理是红枣基本的加工方式，超声以及微波条件的不同均对红枣中含有的活性成分造成不同程度的影响，使制备的枣汁具有不同程度的抗氧化活性。郑炯等[7]发现超声波处理与空白对照组相比，西瓜汁L-抗坏血酸含量稍有降低，多酚物质含量变化不明显。Muhammad Abid 等[8]通过研究证明了超声处理能显著提高苹果汁中抗坏血酸、酚类化合物、抗氧化能力、DPPH自由基清除活性。Pérez-Grijalva 等[9]通过超声和微波处理黑莓果汁，探究其活性物质及微生物质量，结果表明在微波处理60 s 和柠檬酸浓度为500 mg/kg 时，黑莓汁中多酚和单体花青素的含量最高；超声和微波处理样品中均检出酚酸、黄酮醇和氰苷；在贮藏过程中，超声处理的果汁保留了90%以上的单体花青素，并表现出显著的微生物负荷降低。但是关于超声和微波复合处理条件下对果汁营养成分和抗氧化性影响的研究相对较少，尤其是干红枣汁切片提汁的前提条件再结合超声波和微波技术的部分基本未涉及。鉴于此，本项目研究了自然浸出、超声波、微波、超声波和微波两者的复合技术及所得枣汁的营养成分和抗氧化活性。通过不同浸出方式的比较，研究超声波和微波对枣汁中的多酚、黄酮、维生素C、环核苷酸类以及总还原力、DPPH 自由基、Fe2+螯合力、超氧阴离子自由基、羟基自由基等清除力的变化，以此来说明抗氧化活性变化情况，进一步体现超声波和微波协同处理对于食品中营养成分和抗氧化活性的影响，以期为超声波和微波两种技术的复合使用提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆骏枣，购自临汾万家福超市。2,6-二氯靛酚、抗坏血酸、碳酸氢钠、3,5-二硝基水杨酸、福林酚试剂、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、水杨酸、30%过氧化氢、无水乙醇、氯化亚铁、邻菲啰啉、硫酸亚铁、三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾均为分析纯，购自天津市光复科技发展有限公司。环磷酸腺苷标准品（纯度99%）、环磷酸鸟苷标准品（纯度98%），均购自山东西亚化学股份有限公司。DPPH 购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 LC 高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；CP214 万分之一电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；DZKE-D-2 电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；752N 紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；JY92-IIDN 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；G70D20CN1P-D2 微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；JZM-2506 料理机，中山市金正生活电器有限公司。

1.3 枣汁制备方法

将干红枣用流动水洗净（过程迅速），擦干，除去表面污垢和枣核，切片，厚度约为3 mm 左右，称取一定量的枣片和水于烧杯中，使料水比为1:4（g/mL）。分别用不同的方法对此混合物进行处理，平衡一段时间，直到枣汁的可溶性固形物含量不再发生变化，过滤，得到枣汁；置于合适的容器中，4 ℃低温储存备用。

1.4 试验设计

试验采用6 种不同的方法处理枣片，包括自然浸出、超声处理、微波处理、先超声后微波处理、先微波后超声处理、榨汁。通过预试验得到相关参数，分别为超声处理均为功率540 W，时间15 min；微波处理功率560 W，时间2 min；所有的处理过程料水比均为1:4。另外，微波处理时，因其作用过程中受热而部分水分散失导致料水比变化，因此处理结束后应该补足散失的水分使料水比恒定，便于比较不同处理各指标的变化，进而体现出差异。

1.5 测定指标

多酚的测定参照邵佩等[10]的方法。黄酮的测定采用NaNO3-Al(NO3)3-NaOH 方法[11]。还原型维生素C 含量的测定采用2,6-二氯靛酚滴定法，且整个试验步骤应在避光条件下进行[12]。环核苷酸类物质的测定参照Thomas Van Damme 等[13]的方法，且色谱条件为流速0.2 mL/min，柱温25 ℃，流动相比水:甲醇＝80:20，测定波长为254 nm。DPPH 自由基清除能力的测定根据熊双丽等[14]的方法略作修改，在避光条件下进行。总还原力的测定以没食子酸（GA）标准溶液绘制标准曲线，并采用铁氰化钾-三氯乙酸-FeCl3方法于700 nm 下测定其吸光度，结果以没食子酸当量（GAE）计算[15]。Fe2+螯合力的测定根据Chen 等[16]的方法。羟基自由基清除能力的测定采用水杨酸-乙醇法[17]。超氧阴离子自由基清除能力的测定采用邻苯三酚氧化法，同时以邻苯三酚的自氧化速率作为对照[18]。

1.6 统计说明

所得数据采用Excel 2007（Microsoft Corporation，USA）和SPSS 20.0（Chicago，USA）软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对红枣汁多酚含量的影响

图1 显示了不同处理方式对红枣汁多酚含量的影响。由图可以看出，自然浸出状态下总酚的含量最高，为0.046 1 mg/mL；其次是先超声后微波组为0.042 9 mg/mL，而先微波后超声组的含量为0.0352mg/mL，这两组的总酚含量分别比自然组减少了6.94%、23.64%。由此说明先超声后微波组比先微波后超声组对多酚物质的破坏能力小，前者可以更好地保留多酚物质。而经过先超声后微波处理的枣汁中含有的总酚量均比超声和微波单一处理下获得的红枣汁总酚量多，且均存在显著性差异。可见，榨汁处理方式对红枣汁中酚类物质的破坏力是最大的。

2.2 不同处理方式对红枣汁黄酮含量的影响

图2 显示了不同处理方式对红枣汁中黄酮含量的影响。从图中可以看出，超声和自然浸出组间无显著性差异，说明超声波处理对黄酮的影响不大；微波处理使黄酮含量显著减少；而超声和微波复合处理组中，先超声后微波组比先微波后超声组的黄酮保留率高，约10%，而前者黄酮含量也比微波组高，说明微波虽然对黄酮的影响较大，但先经过超声处理的红枣汁中溶出的某些物质可能对黄酮起到了保护作用，使得红枣汁再经微波处理后比直接微波处理的黄酮含量高；而先微波后超声组和微波组间黄酮含量并无显著性差异，进一步论证了超声对黄酮并无明显的破坏作用；榨汁得到的红枣汁中黄酮的含量最高，为23.22 μg/mL，且与其他各组间均存在显著性差异。可能是由于榨汁对红枣果肉的破碎程度大，黄酮类物质溶出较多。

2.3 不同处理方式对红枣汁维生素C 含量的影响

维生素C 是红枣中重要的营养成分之一，且在红枣中的含量较高[19]。图3 显示了不同处理方式对红枣汁中维生素C 含量的影响。由图可知，自然浸出下，还原型维生素C 的含量最高，为7.02 mg/mL，而经超声、微波、先超声后微波、先微波后超声和榨汁处理后，还原型维生素C 的损失率分别达到了39.54%、30.11%、70.27%、63.88%和34.04%。超声、微波和榨汁，超声和微波两复合处理，组间不存在显著性差异，表明超声和微波对还原型维生素C 的破坏作用是等同的，而榨汁对还原型维生素C 的破坏力同超声和微波单一处理不存在差异。

2.4 不同处理方式对红枣汁环核苷酸类含量的影响

环核苷酸类物质是红枣中特有的成分，包括有环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷。图4 中为处理后的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷含量的变化情况。6 种处理中cAMP 含量最高的是经过先微波后超声的红枣汁，为181.45 mg/L，其次是先超声后微波组，含量为161.48 mg/L，且两组间无显著差异，与自然浸出组相比，前者提高了22.00%，存在显著差异，后者仅提高了12.35%，且无显著差异。超声、微波、榨汁与自然浸出组相比，cAMP 含量不存在差异。超声和微波单一处理下cAMP 含量的变化说明微波作用对于cAMP 的溶出比超声作用有极小的优势。但超声波和微波单一处理对于cAMP 的影响等同于榨汁对红枣果肉中cAMP 的溶出作用。超声和微波复合处理下cAMP含量比自然浸出组和两者的单一处理组都略有升高，说明其复合处理对果肉中cAMP 提取有一定的作用，其中以先微波后超声更有利于cAMP 的提取。可能是由于微波热作用使得果肉中cAMP 较快速的溶出，而超声过程中更多的作用于其他物质，对cAMP 的作用较小。

自然浸出组的cGMP 含量为1 282.04 mg/L，超声、微波、先超声后微波、先微波后超声和榨汁中cGMP 含量分别为1 494.83 mg/L、1 336.93、1 420.83、1 404.58 mg/L，分别比自然组高14.24%、4.11%、9.77%、8.72%。而榨汁组cGMP 为1 119.92 mg/L，且显著低于自然浸出组，说明榨汁产生的机械作用可能对cGMP 的结构产生了破坏作用。而经过其他微波和超声的处理，无论是两种技术的单一处理还是两种技术的复合处理都使得枣果肉中的cGMP的含量高于自然浸出组，表明两种技术均有利于cGMP 的提取。超声和微波复合处理下，先超声后微波组cGMP 的含量与先微波后超声组两者间不存在显著差异。

2.5 不同处理方式对红枣汁抗氧化活性的影响

抗氧化活性是用来评价低浓度存在的物质能够有效抑制自由基氧化反应的重要指标，其可以直接作用在自由基，或间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。评价抗氧化活性的指标有总还原力、自由基清除率以及螯合力等。表征枣汁的抗氧化活性变化的情况如图5 所示。

2.5.1 不同处理方式对红枣汁DPPH·清除率的影响

由图5 可知，在6 种处理下，DPPH 自由基清除率较强的为微波组和榨汁组，分别为93.31%和94.96%，且两组间不存在显著差异。其他各组间两两相比较，DPPH 自由基清除率均不存在明显差异。可以说明超声以及微波和超声两组复合处理间产生能与DPPH 自由基反应的物质的能力相当。先微波后超声的清除率达90.8%，与微波组和榨汁组间都不存在明显差异。先超声后微波组清除率为88.47%，与微波和榨汁组存在显著性差异。由此可以说明先微波后超声对于产生能与DPPH 自由基反应的物质的作用稍强于先超声后微波组。

2.5.2 不同处理方式对红枣汁总还原力的影响

总还原力中以自然浸出条件下最低，为0.016 2 GAE mg/mL，而经过超声、微波以及榨汁条件下均有升高，且各组与自然组相比均有显著性差异。微波处理下枣汁的总还原力最高，为0.021 2 GAE mg/mL，超声处理后枣汁总还原力为0.018 4 GAE mg/mL，分别比自然组高出23.58%、15.71%，显然微波作用比超声波作用使枣汁具有更高的还原力。超声波和微波复合处理得到的枣汁的总还原力均高于自然浸出组，先超声后微波总还原力为0.017 8 GAE mg/mL，先微波后超声的总还原力为0.020 7 GAE mg/mL，两者相差约14%，且存在显著性差异。这一现象说明了微波和超声复合处理下，微波和超声处理顺序对枣汁总还原力的影响不同，以先微波后超声更有利于枣汁中具有较强还原力的物质的溶出，从而使得总还原力得到提升。

2.5.3 不同处理方式对红枣汁Fe2+螯合力的影响

Fe2+螯合力表示的是物质通过提供孤对电子与该离子形成配位键的能力。图5 中Fe2+螯合力分别为超声20.21%、微波29.13%、先超声后微波25.46%、先微波后超声25.20%、榨汁29.40%，与自然浸出组16.01%相比较均有显著差异；经过处理的枣汁的螯合力分别提升了20.78%、45.04%、37.11%、36.47%、45.54%，其中微波和榨汁组、两组超声和微波复合处理组间各无显著差异。超声处理下的枣汁Fe2+螯合力优于自然浸出组。该结果反映出超声、微波以及榨汁均可以提高枣果肉中可以提供配位电子与Fe2+形成配位键的物质含量，且该物质的生成与微波的热作用有很大的关系，超声的作用存在但不及微波作用，超声和微波的复合作用比微波作用下枣汁螯合物质的产生能力相对较弱。

2.5.4 不同处理方式对红枣汁·OH 清除率的影响

羟基自由基（·OH）是一种氧化能力很强的自由基，通过得到电子的方式，能使多糖和蛋白质等物质分解。羟基自由基清除率表明了枣汁中容易与羟基自由基反应的物质的多少。从图5 中可以观察到，榨汁中得到的枣汁的羟基自由基清除率最高达83.10%，与自然浸出组的68.60%相比较存在显著性差异。与自然浸出组相比，微波和超声处理中以超声、先超声后微波得到的枣汁的清除率较低，且存在显著性差异；以微波、先微波后超声的清除率较高，且不存在显著性差异。说明超声可以破坏与羟基自由基反应的物质，从而减弱枣汁失去电子的能力，且作用显著；而微波对于该类物质的破坏作用不显著。

2.5.5 不同处理方式对红枣汁O2·-清除率的影响

超氧阴离子自由基是通过分子氧还原而得到的，可衍生为其他自由基的形式，与蛋白质、核酸等物质发生反应。该自由基通过失去本身多出的电子而与其他物质反应。图5 中自然浸出组和榨汁组的超氧阴离子自由基清除率较其他处理组高，分别为33.27%、31.94%。而经超声和微波处理得到的枣汁中超氧阴离子自由基清除率均有所下降，且与自然浸出组相比有显著性差异，各组的清除率分别为超声21.10%、微波25.10%、先超声后微波23.76%、先微波后超声29.47%，各下降了36.57%、24.56%、28.58%、11.42%。超声处理下清除率最低，微波和先超声后微波两组间的清除率未有显著差异，以先微波后超声枣汁中该自由基的保留率最弱，说明该处理下得到的物质更易于与超氧阴离子反应。与另一组复合处理相比，先微波后超声得到的红枣汁中含有的能与超氧阴离子反应的物质较高，而使得该自由基清除率升高。

2.6 相关性分析

表1 显示了不同抗氧化性间的相关性。由表1 相关性分析可知，黄酮与多酚、cAMP、cGMP、总还原力、Fe2+螯合力呈负相关，与cAMP、cGMP 相关性略高。多酚与·OH清除率、O2·-清除率呈负相关，而多酚与总还原力、DPPH·清除率、Fe2+螯合力呈现较强的负相关性（P＜0.05），说明总酚的含量与枣汁中的总还原力、DPPH 自由基清除率、Fe2+螯合力息息相关，且总酚含量越大，这三个值越小。维生素C 与cAMP、cGMP、总还原力、Fe2+螯合力呈负相关。维生素C 与cAMP、多酚和·OH 清除率的相关性均在0.6 左右。cAMP 与DPPH 清除率、·OH 清除率、O2·－清除率呈负相关。cGMP 与其他各抗氧化活性指标均呈现负相关性，其中与·OH 清除率呈极强的负相关性（P＜0.01）。cGMP 与DPPH 清除率、cGMP 和O2·－清除率、DPPH 清除率和总还原力、DPPH 清除率和Fe2+螯合力、·OH清除率和O2·－清除率等相关性均约为0.7，存在一定的相关性，但相关性不高，其具体在枣汁中的作用的相互性有待于进一步研究。总还原力与O2·－清除率、O2·－清除率和Fe2+螯合力也呈负相关。除此之外，其他各指标间呈现正相关关系，其中总还原能力和Fe2+螯合力、DPPH 清除率和·OH 自由基清除率具有较高的正相关度（P＜0.05），说明总还原力可以较好地反应枣汁中Fe2+螯合力、DPPH 清除率和·OH 清除率等抗氧化活性。

表1 相关性分析Table 1 Correlation analysis

3 讨论

与自然浸出组相比，超声波和微波复合处理中，多酚、黄酮、还原型维生素C 的含量均有所降低，且存在显著性差异，而cAMP 和cGMP 含量则略有升高，且先微波后超声对于多酚和黄酮以及cAMP 的保留率比先超声后微波高，而还原型维生素C 的含量反而低，且cGMP 含量不存在明显差异。经过先超声后微波处理的红枣汁中含有的总酚量均比超声和微波单一处理下获得的红枣汁总酚量多，造成该现象的原因可能是，榨汁过程中的机械作用使多酚物质与更多与之相关的反应物充分接触，如可能活化了的多酚氧化酶促使多酚发生酶促反应，从而降低了酚类物质的含量[20]。还可以得出红枣汁中多酚含量经过机械处理会发生不同程度的损失。经过处理的红枣汁由于处理方式不同呈现出不同的抗氧化活性。榨汁组除超氧阴离子自由基清除率等同于自然浸出组外，其总还原力、DPPH 清除率、·OH 清除率、Fe2+螯合力均比自然浸出组高。而超声和微波中，总还原力中微波＞先微波后超声组＞超声＞先超声后微波＞自然浸出组；DPPH 清除率中微波组最高；·OH 清除率中与自然浸出组相比较受到影响而导致清除率降低的是超声和先超声后微波组；O2·－清除率比自然浸出组低，但以先微波后超声受到的影响小；Fe2+螯合力均高于自然浸出组，以微波作用最为显著，两复合处理组螯合力低于微波组。综上所述，先微波后超声组中除维生素C 的含量比先超声后微波组的低外，该组的多酚、黄酮、cAMP、cGMP 以及其抗氧化活性等均优于先超声后微波组。

通过相关性数据分析得出，总酚可以较好地反映部分抗氧化活性，除cGMP 的多少可以明确的表达红枣汁中·OH 清除率的大小外，黄酮、维生素C、cAMP、cGMP与抗氧化活性相关度不高，其具体的作用机理尚不明确，同时总还原力可以较好地反映枣汁所具有的抗氧化活性。

4 结论

对超声和微波等不同处理方式下得到红枣汁的部分主要成分及抗氧化能力的综合分析,能够为红枣的综合利用提供依据。红枣处理方式不同，得到的红枣汁的理化性质、营养物质与抗氧化能力也会有差别。微波组总酚的含量最低，自然浸出组总酚含量最高，而超声和微波复合处理组中以先微波后超声的总还原力、DPPH 清除率、Fe2+螯合力较强。总还原力几乎可以表达所有的抗氧化活性指标。以微波的枣汁总抗氧化活性高，其次是先微波后超声抗氧化活性和榨汁组较高。O2·－清除率中，先微波后超声组所具有的清除率较适宜，榨汁组高于微波组。榨汁组中黄酮含量最高，维生素C 含量保留较多，cAMP、cGMP 含量最低。微波组中维生素C、黄酮保留也较好，但cAMP、cGMP 含量次于先微波后超声组而高于榨汁组。先微波后超声组中的黄酮含量为15.17 μg/mL，维生素C 含量较少，为2.54 mg/mL，cAMP、cGMP 含量较高，分别为181.45 mg/L 和1 404.58 mg/L。所以，先微波后超声处理下得到的枣汁的营养成分较好地得到保留，除环核苷酸类物质外，该组的营养成分损失略多于自然浸出组，而抗氧化活性要优于自然处理组。