实验室检测苹果汁中甜蜜素的能力分析

景赞，刘超，刘晓碧

（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）

甜蜜素是一种人工合成的甜味剂，在食品工业生产中具有甜度高、用量少、价格低等优点，因而应用广泛。GB 2760 食品添加剂使用标准中，对甜蜜素的使用范围和限量都有明确规定，但分析近几年国家公布的抽检数据发现，甜蜜素滥用问题比较突出，白酒、馒头中检出较多，食品安全形势依然严峻，对检验检测机构的能力要求也越来越高[1-3]。

能力比对作为一种提升检测水平的手段在质量控制中较为常见，通过比对考核能够发现和检验各环节中的干扰因素，评估其对测定结果的影响大小，识别实验室中的问题并制定相应的措施，从而提升检测机构的能力水平[4-7]。本文着眼于苹果汁中的甜蜜素含量测定，分别采用气相色谱法和液质联用法对样品进行检测，通过此次考核加强食品安全检测的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜蜜素标准品，纯度99.7%，购于坛墨质检科技股份有限公司；正庚烷，色谱纯；赛默飞世尔科技（中国）有限公司；亚硝酸钠、硫酸、氯化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪，7890A，安捷伦科技中国有限公司；液质联用仪，API3200，AB SCIEX 公司。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 气相法

称取甜蜜素标准品适量，用超纯水稀释至1 000 μg/mL，准确移取0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、4.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，得到浓度为10、20、40、80、100、160 μg/mL 的标准系列工作溶液。

1.3.2 液质法

准确移取上述标准品（1 000 μg/mL）1.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，得到浓度为10 μg/mL 的标准中间溶液，分别移取0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用超纯水定容，得到浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/mL 的标准系列工作溶液。

1.4 样品前处理

1.4.1 气相法

苹果汁试样摇匀后称取10.000 0 g，用水定容至25 mL，准确移取10.0 mL 试样于50 mL 带盖离心管中。置于冰浴10 min 后，加入5.0 mL 正庚烷，分别加入2.5 mL亚硝酸钠和硫酸溶液，盖紧盖子，摇匀，在冰浴中放置30 min，其间振摇5 次。加入2.5 g 氯化钠，盖上盖子后振摇80 次，低温离心（3 000 r/min）10 min 分层，取上清液经0.22 μm 有机滤膜过滤后待测定。

1.4.2 液质法

苹果汁试样摇匀后，称取1.000 0 g，用水定容至100 mL摇匀，取1 mL 定容至5 mL，经0.22 μm 水相微孔滤膜过滤后待测定。

1.5 仪器条件设置[8]

1.5.1 气相法

进样口温度：220 ℃，分流比：10:1；色谱柱：HP-5 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱温箱升温程序：初始温度60 ℃（保持2 min），以10 ℃/min 升至90 ℃（保持0.5 min），再以20 ℃/min 升至230 ℃，保持3 min；流速：2 mL/min；进样体积：1 μL；载气：高纯氮气；FID 检测器温度：260 ℃。

1.5.2 液质法

（1）液相条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 mm）；流速：0.4 mL/min；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；流动相:甲醇、10 mmol/L 乙酸铵溶液。

梯度洗脱：0.01 min，5%甲醇；0.01～5.00 min，甲醇5%～15%；5.00～8.00 min，甲醇15%～30.0%；8.00～9.00 min，甲醇30.0%～80.0%；9.00～13.00 min，甲醇80.0%～80.0%、13.00～13.10 min，甲醇80.0%～5.0%；13.10～15.00 min，甲醇5.0%～5.0%。

（2）质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；监测方式：多反应监测MRM；雾化气、气帘气、辅助加热器、碰撞气均为高纯氮气；IS：-4 500 V；GS1：30 Psi；CUR：30 Psi；GS2:30 Psi；温度：500 ℃；CAD：110 mL/min。具体质谱条件见表1。

表1 甜蜜素质谱参数Table 1 MRM parameters of sodium cyclamate

2 结果与分析

2.1 检测方法的选择

目前检测甜蜜素的方法有气相色谱法、液相色谱法、液质联用法，气相和液相法均需要衍生化，液质法纯水稀释后直接测定，从前处理看液质法有很大优势。考虑到对比衍生化和未衍生、色谱与质谱，最终选择气相色谱和液质联用法[9-11]。甜蜜素标准色谱图见图1、2。

2.2 影响分析结果的因素和关键控制点

标准品要稳定、来源可靠，且要求带有检验报告证书，同时按照标明的储存条件进行存放，使用前温度应恢复至室温。能力考核样接收时是冷藏状态，实验室也应存放在冷藏环境中，在使用前恢复至室温并充分混匀。检测过程中用到的移液器、容量瓶、移液管等器具应检定校准，如无法校准检定应通过自校，保证器具的准确性[12]。气相法测定中衍生环境的控制尤为重要，移取10 mL样品至离心管预冷阶段应尽可能长，衍生温度最好控制在10 ℃以下，同时对冰浴水温的均一性也要注意，可以购买带循环水功能的冰浴设备，否则应间隔搅动，防止水温不均造成衍生效果不好。气相色谱衬管的清洁程度会影响目标物的响应值，检测时应及时更换，同样液质离子源也应及时维护清洁。测定标准溶液时，尽量不要使用仪器自动稀释功能，可能会带来较大的偏差。样品基质的影响在检测中也不能忽略，试验考察了苹果汁基质配标与纯溶剂配标的差异性，结果显示两者峰面积近似，带来的偏差很小。

2.3 方法的线性关系

以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，绘制标准曲线，在所测定浓度范围内，线性关系良好，结果见表2。

表2 甜蜜素的线性范围Table 2 Linear range of sodium cyclamate

2.4 实际样品测定

将能力考核样平均分成10 份，按照上述气相色谱法和液质联用法前处理方法进行提取测定，结果见表3。

将两种方法测定的结果进行t检验分析，样本量n＝10，自由度df＝9，双侧检验α＝0.05，计算结果P＞0.05。统计上没有显著性差异，可以认为气相色谱法与液质联用法在测定苹果汁甜蜜素时结果间无显著性差异。

2.5 统计结果分析

此次能力考核参加单位共有15 家，统计结果数据采用稳健统计法，包括计算结果数、中位值、标准化四分位距、稳健变异系数、最小值、最大值和极差。再根据中位值和标准化四分位距计算出实验室间Z比分数（ZB）和实验室内Z比分数（ZW），依据Z比分数评定实验室的结果，定义为|Z|≤2 为满意，2＜|Z|＜3 为可疑，|Z|≥3 为不满意[9]。苹果汁中甜密素测定的ZB、ZW柱状图见图3、4。

表3 气相法和液质法结果比较Table 3 Comparison of testing results by GC and LC-MS/MS

根据统计结果，本实验室ZB、ZW值均小于2，结果较为满意，参加能力考核的15 家实验室中，其中1 家结果可疑，2 家结果为不满意，实验室出现可疑或者不满意结果时，可以从影响结果因素和关键控制点分析产生问题的原因，建立相关纠正措施，做好标准物质和试剂的验收保管，加强人员业务培训，规范仪器设备维护保养，对新方法、新仪器的使用进行集中培训学习，同时实验室的内部质控也很重要，通过购买相应的质控样进行处理，是保证结果准确稳定的有效手段。

3 讨论

本文分别采用气相色谱法和液质联用法测定苹果汁中甜蜜素含量，并对测定结果进行差异显著性分析，同时从自身实验室角度，总结了甜蜜素检测环节中的影响因素和关键控制点，对于能力验证出现可疑或者不满意结果的其它实验室可作为参考，建立相关的纠正和预防措施，不断提升实验室检测能力水平。